專利藥羥基喜樹堿戊二酸單脂體外抗肝癌活性研究

魏 英，王靳琎，黃慧敏，陳琴華

0 引言

肝癌是世界上第五大常見癌癥，嚴重威脅著人類健康，5年生存率較低 (約15%，偏遠地區(qū)僅為2%)[1]。手術(shù)是原發(fā)性肝癌的首選治療方法，但80%～90%的患者確診時已發(fā)生廣泛的肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移，錯過手術(shù)時機。放化療可有效提高局部控制率，改善遠期生存率。

羥基喜樹堿(Hydroxy camptothecin，HCPT)是一種廣譜的抗腫瘤藥，是從喜樹的皮、果實中提取得到的一類色氨酸-萜烯生物堿，屬于細胞周期特異性藥物，主要作用于DNA合成期(S期)，對原發(fā)性肝癌具有治療作用[2-4]。HCPT為水不溶和脂難溶性藥物，很難通過生物膜進入組織和細胞，半衰期非常短，而且藥物穩(wěn)定性非常差，分子內(nèi)部的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)容易在中性和堿性條件下開環(huán)，降低藥物活性，不易發(fā)揮長效抗腫瘤作用[5-6]。課題組根據(jù)前藥原理，在HCPT的10位引入戊二酸基團對其結(jié)構(gòu)進行適當修飾，得到羥基喜樹堿戊二酸單酯(Hydroxy camptothecin glutaric acid monoester，HCPT-GCM)偶合物(見圖1)，并申請了專利，專利號為：201610692633.2。HCPT-GCM的水溶性(20.17 μg/ml)遠大于HCPT(4.64 μg/ml)。本研究以HCPT為對照，觀察細胞對HCPT和HCPT-GCM的攝取情況；不同濃度的HCPT-GCM作用于肝癌H22細胞株，初步探討HCPT-GCM對肝癌細胞株增殖抑制作用，現(xiàn)報到如下。

圖1 HCPT-GCM的結(jié)構(gòu)(在HCPT的10位引入戊二酸基團)

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑 人肝癌細胞株H22 購于武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心，羥基喜樹堿購于北京索萊寶科技有限公司，HCPT-GCM由課題組合成，胎牛血清、細胞計數(shù)Kit-8試劑盒購購于美國Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司。

1.2 主要實驗儀器 全波長酶標儀購于美國Biotek公司，生物安全柜購于中國Heal Force公司，CO2培養(yǎng)箱購于法國Thermo公司，熒光顯微鏡購于德國Carl zeiss AG公司，高效液相色譜儀(Agilent 1260 InfinityⅡ)。

1.3 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細胞株H22，當細胞覆蓋80%～90%瓶底后,用0.25%的胰酶-EDTA消化傳代，進行各項實驗。

1.4 細胞攝取實驗 50.0 μM的HCPT-GCM、HCPT分別作用于H22細胞0.5、4 h后。1份用冷PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS溶液清洗3次，PI染色15 min，熒光顯微鏡觀察細胞對2種藥物的攝取情況；羥基喜樹堿被細胞攝取后，在360 nm的激發(fā)光波的作用下發(fā)射出440 nm的光波，熒光顯微鏡下可觀察到藍紫色熒光顆粒[7]；PI 被細胞攝取后，460～550 nm光波激發(fā)后,顯微鏡下可觀察到紅色熒光，通過比較細胞內(nèi)紫藍色熒光顆粒的多少,直觀判斷細胞對2種藥物的攝取情況。另1份用冷的PBS 溶液清洗3次，每孔加入1 ml細胞裂解液，室溫裂解1 h，收集溶液加入20 μl磷酸緩沖液；12 000 r/m離心10 min，取20 μl上清液注入高效液相色譜儀(HPLC)測定藥物濃度，計算細胞對藥物的攝取情況。

1.5 MTT試驗 體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細胞株H22，調(diào)整細胞密度為1×104/ml，96孔板中培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入含不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μM)的HCPT-GCM及HCPT的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)5個平行孔，作用48 h后，細胞計數(shù)Kit-8試劑盒490 nm波長下測定吸光值OD，計算HCPT-GCM及HCPT對人肝癌細胞株H22的增殖抑制率。

1.6 細胞周期試驗 體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細胞株H22，調(diào)整細胞密度為1×104/ml，6孔板中培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入含不同濃度(0、1.0、2.5、5.0 μM)的HCPT-GCM的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)3個平行孔，作用24 h后，按照說明書收集細胞，75%冷乙醇固定，冷PBS清洗細胞，PI染色，流式細胞儀分析周期。

2 結(jié)果

2.1 細胞對藥物的攝取情況 50.0 μM的HCPT-GCM和HCPT分別作用于H22細胞0、0.5、4 h后，熒光顯微鏡下顯示,HCPT-GCM處理組細胞內(nèi)藍紫色熒光顆粒較HCPT處理組多(見圖2)，表明HCPT-GCM更易通過細胞膜進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。HPLC法結(jié)果也顯示,HCPT-GCM處理組細胞內(nèi)藥物濃度較HCPT處理組高，HCPT-GCM更易進入細胞(見圖3)。

圖2 肝癌H22細胞對HCPT-GCM和HCPT的攝取情況(×200)

圖3 肝癌H22細胞對HCPT-GCM和HCPT的攝取情況(HPLC法)

2.2 藥物對細胞增殖的抑制作用 不同濃度的HCPT-GCM及HCPT分別作用于H22細胞48h后，各濃度的2種藥物對H22細胞增殖均有一定的抑制作用，藥物濃度小于5.0 μM時，隨著藥物濃度的增加對細胞增殖的抑制率增強，大于5.0 μM時，隨著藥物濃度的增加對細胞增殖的抑制作用改變不明顯；藥物濃度為0.5、1.0、2.5、5.0 μM時，HCPT-GCM對H22細胞的增殖抑制作用較HCPT強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。以上結(jié)果表明，2種藥物對肝癌細胞株H22均有明顯的增殖抑制作用，且HCPT-GCM的抑制作用更強。

表1 HCPT-GCM對肝癌H22細胞增殖的抑制作用

2.3 HCPT-GCM對H22細胞周期的作用 0、1.0、2.5、5.0 μM的HCPT-GCM作用于H22細胞24 h后，PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期。與對照組相比較，1.0、2.5、5.0 μM的HCPT-GCM組細胞G2/M期顯著減少，S期顯著增加，細胞周期阻滯在S期(圖4，表2)。

圖4 HCPT-GCM對肝癌H22細胞細胞周期的影響

表2 HCPT-GCM對肝癌H22細胞細胞周期的影響

3 討論

羥基喜樹堿是一種細胞周期特異性抗腫瘤藥，通過抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I，對多種腫瘤具有較強的抗腫瘤活性[8-9]。研究證明，HCPT對原發(fā)性肝癌具有治療的作用[10-11]。但HCPT為水不溶和脂難溶性藥物，半衰期非常短，分布半衰期為5 min左右，消除半衰期為30 min，難以通過生物膜進入組織和細胞，不易發(fā)揮長效抗腫瘤作用[12]；HCPT包含細胞毒作用的內(nèi)酯環(huán)，水溶性極差，一般將其制成水溶性鈉鹽針劑；當pH<5時，以羥基內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)存在，在較高pH環(huán)境下，迅速水解成羧酸形結(jié)構(gòu)，喪失活性[13-16]。為達到治療目的，實際用量遠超理論用量，使得藥物胃腸道反應(yīng)、腎毒性和骨髓抑制等毒副作用較大[17-19]。因此，對HCPT進行局部修飾、有效提高水溶性、克服轉(zhuǎn)運過程中失效等問題具有重要意義。HCPT-GCM偶合物是在HCPT的10位引入戊二酸基團對其結(jié)構(gòu)進行適當修飾得到的，目前對HCPT-GCM的研究尚處在起始階段。

喜樹堿被細胞攝取后，在360 nm的激發(fā)光波的作用發(fā)射出440 nm的光波，熒光顯微鏡下可觀察到藍紫色的熒光[7]。本課題組應(yīng)用喜樹堿的這一特點做了細胞攝取實驗，結(jié)果顯示，50.0 μM的HCPT-GCM和HCPT分別作用于肝癌H22細胞0.5、4 h后，H22細胞在2個時間點對HCPT-GCM的吞噬作用均較HCPT強，證明HCPT-GCM更易通過細胞膜進入細胞內(nèi)；同時，HPLC法藥物濃度測定進一步證明HCPT-GCM較HCPT更易進入細胞內(nèi)。這與前期專利申請的研究結(jié)果相符，HCPT-GCM的溶解度遠大于HCPT。

MTT試驗結(jié)果顯示，0.5、1.0、2.5、5.0 μM的HCPT-GCM和HCPT分別作用于肝癌細胞株H22 48 h后，HCPT-GCM對H22細胞的增殖抑制作用較HCPT強，表明HCPT-GCM對肝癌細胞株H22具有更強的體外抑制作用。當濃度大于5.0 μM時，隨著藥物濃度的增加對細胞增殖的抑制作用增加不明顯，表明，HCPT-GCM最佳作用濃度小于5.0 μM。

羥基喜樹堿是細胞周期特異性抗腫瘤藥，根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選取對細胞增殖抑制率較好的藥物濃度(1.0、2.5、5.0 μM)的HCPT-GCM作用于H22肝癌細胞株24 h，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，細胞G2期減少，S期顯著增加，細胞阻滯在S期，表明，HCPT-GCM使H22細胞周期停止于S期，干擾了細胞DNA的復(fù)制，從而抑制了細胞的增殖。

綜上所述，HCPT-GCM較HCPT更易通過細胞膜，且HCPT-GCM對肝癌細胞株H22的增殖抑制作用較HCPT強；HCPT-GCM作用于細胞周期，使細胞周期停止于S期，干擾DNA的復(fù)制是其抑制細胞增殖的作用機制之一。HCPT-GCM作為一個專利藥，其穩(wěn)定性、體內(nèi)藥物代謝動力學、組織分布、生物安全性、體內(nèi)外抗肝癌活性及其原理等相關(guān)問題，課題組后期將做進一步的研究報道。