不同濃度乙二胺四乙酸在產ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星3種藥物體外敏感性的恢復作用

溫慶輝,徐軍發,李燕嫦,黃金印

0 引言

隨著抗菌藥物種類增加,抗菌藥物濫用等情況導致耐藥菌株產生,并且變化速度快[1]。肺炎克雷伯菌是革蘭陰性菌,腸桿菌科屬,屬于條件致病菌,能夠引起消化系統感染、泌尿系統感染和呼吸道感染等,其也是導致院內感染的重要原因之一[2]。近年來,廣譜抗菌藥物使用范圍擴大,肺炎克雷伯菌對多數一線藥物產生耐藥性,其耐藥機制是產生碳青霉烯酶、AmpCβ內酰胺酶、超廣譜β-內酰胺酶等[3- 4]。耐藥菌株常同時攜帶碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氯霉素、磺胺類等耐藥基因,具有多種耐藥機制,呈多重耐藥的特點。

乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)是一種金屬螯合劑,曾被用于治療鉛、汞等中毒。由于其能隔絕鎂離子、鈣離子、鐵離子、鋅離子,也被作為滲透劑及加強劑用于治療與醫療設備、牙科、獸醫類有關的有菌膜生長的傷口,其能夠增加細菌細胞壁厚度,引起菌膜萎縮,發揮治療作用。研究表明,EDTA能夠控制尿道、血管內細菌菌膜的生長,減少感染發生,也能結合活性物質如抗生素、乙醇、碘、銀等控制菌膜、微生物生長[5-6]。目前,關于EDTA在恢復多重耐藥肺炎克雷伯菌對部分抗菌藥物敏感性中的作用的研究較少。本研究選取多重耐藥肺炎克雷伯菌患者作為研究對象,分析不同濃度EDTA在恢復多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星3種藥物敏感性中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2018年1月至2019年12月產ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌感染患者36例,其中男23例,女13例,平均年齡(50.67±5.94)歲;根據不同感染部位分布,呼吸道感染及泌尿道感染最常見,其次是消化道與切口部位;其中肺部感染16例,泌尿系感染11例,腹部感染5例,傷口感染4例。藥敏報告顯示，對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星3種藥物敏感。本研究經醫院倫理委員會審批。

1.2 試劑 EDTA注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號:0504091);哌拉西林他唑巴坦鈉(國藥準字J20150041,惠氏制藥有限公司);阿米卡星(國藥準字H23021795,哈藥集團三精制藥有限公司);左旋氧氟沙星(國藥準字H20010538,江蘇漣水制藥有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 體內治療與觀察 采取倍比稀釋法配置高、中、低3種不同濃度的EDTA[高濃度EDTA注射液1g，qd(出廠成品);中濃度EDTA注射液0.5 g,qd(經1∶2稀釋而成);低濃度EDTA注射液0.25 g,qd(經1∶4稀釋而成)],分別將患者隨機分為低濃度組、中濃度組及高濃度組，各12例,觀察臨床療效及不良反應。

1.3.2 體外藥敏試驗和生物膜抑制試驗 先將受試藥物配成相應濃度的溶液,然后采取瓊脂平皿二倍稀釋法,分受試藥物組、受試藥物+低EDTA組、受試藥物+中EDTA組、受試藥物+高EDTA組,各組平皿加入2 mmol/L的106cfu/ml,分別測定產ESBLs的肺炎克雷伯桿菌的MIC。

1.3.3 生物膜抑制試驗 將LB肉湯培養18 h的肺炎克雷伯菌用新鮮LB肉湯(0.25% 葡萄糖)按1∶1 200比例稀釋。將 0.2 ml稀釋后的菌液加入96孔平底組織培養盤,每株分別移入4個平行孔。在37 ℃培養18 h后,用移液器吸頭吸干每孔菌液,然后用PBS(pH7.2)緩沖液洗板3次,然后用Bouin固定液固定,用結晶紫染色,洗去未黏附細菌,晾干,每孔加入200 μl丙酮乙醇,微振蕩,酶標儀檢測每孔的A570 nm值。生物膜形成陽性株篩選條件為:陰性對照菌株平均A值+3倍標準差為界定值,以平均A值大于界定值為生物膜形成株。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌MIC測定 哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星加入EDTA后,肺炎克雷伯菌MIC降低,敏感性恢復。與受試藥物組比較,低、中、高濃度EDTA組MIC顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與低濃度EDTA相比,中、高濃度EDTA組MIC顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與中濃度EDTA相比,高濃度EDTA組MIC降低,但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 肺炎克雷伯桿菌MIC測定(mg/L,n=20)

2.2 EDTA增強抗菌藥物對肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制作用 哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星加入EDTA后,肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制作用降低。與空白組相比,受試藥物組及低、中、高濃度EDTA組抑制作用顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與受試藥物組相比,低、中、高濃度EDTA組抑制作用顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與低濃度EDTA相比,中、高濃度EDTA組抑制作用顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 EDTA增強抗菌藥物對肺炎克雷伯桿菌生物膜形成的抑制作用(n=9)

3 討論

多重耐藥菌是指對β-內酰胺類、紅霉素、氨基糖苷類3種或3種以上的抗菌藥物均耐藥,耐藥菌株呈逐漸上升趨勢,其以產革蘭陰性菌最為普遍。目前,多重耐藥菌已成為醫學界關注的焦點,關于多重耐藥細菌感染患者治療仍是臨床治療難點。病原學隨著病情、環境的不同發生變化,臨床感染的多重耐藥菌分布也發生了改變。近年來,對多重耐藥的抗菌藥物敏感性的恢復作用引起國內外學者的關注,并開展了一些研究,但不同濃度的EDTA是否能恢復抗菌藥物對多重耐藥菌敏感性方面,目前國內研究甚少。

肺炎克雷伯菌產生耐藥的機制:①藥物滅活酶:耐藥性產生的主要機制。肺炎克雷伯菌屬于革蘭陰性菌,產生多種β-內酰胺酶,水解內酰胺,破壞具有內酰胺結構的抗菌藥物,使其喪失活性。肺炎克雷伯菌對新研發的抗菌類藥物，合成β-內酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷鈍化酶等,作用于抗菌藥物,使其喪失活性,產生耐藥性[7]。②生物膜:細菌外膜未覆蓋被膜物質,當所處環境惡劣時,肺炎克雷伯菌在細胞膜外生成膜,對抗不良因素,保護菌體,使肺炎克雷伯菌免受侵襲[8]。生物膜表面附著的物質,形成營養物質的輸送渠道,保證營養充足供給細菌,與無生物膜細菌相比,其生理特征、侵襲力以及菌體形態等更有優勢,對免疫系統攻擊產生抵抗力,導致抗菌藥物不能作用于菌體,引起藥物失效。③膜孔蛋白的缺失:肺炎克雷伯菌細胞膜上的通道由孔蛋白構成,經此通道為其提供良好的外界物質。若膜孔蛋白發生改變,導致抗菌藥物無法滲入菌體內部,不能發揮作用而失效[9]。④基因突變:對氟喹諾酮類產生耐藥的主要機制是DNA旋轉酶中CyrA 和拓撲異構酶ParC的構象和結構發生變化,導致抗菌藥物無法同酶-DNA復合物結合,其抑制細菌DNA合成的作用受到阻止,出現耐藥性[10]。⑤細菌外排泵作用:肺炎克雷伯菌有向外界排泄有害物質的系統,該排泄系統排泄的物質不具有特異性,多種菌株能夠構成不同能力的排泄系統,當外排系統作用增加,對多種抗菌藥物外排增加,導致肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物產生強耐藥,即多重耐藥性[11-12]。Niu等[13]研究了EDTA與美羅培南聯合應用的體外抗菌活性，結果顯示,EDTA濃度達到一定程度,美羅培南在低濃度抑菌率逐漸上升,美羅培南對于耐藥肺炎克雷伯菌在較低濃度就可以發揮良好的殺菌效果。

根據本文中產ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌感染部位及致病性的不同,發現機體發生呼吸道與泌尿道的感染幾率最高,對此細菌呈一定聚集度,藥物敏感試驗結果更易出現多重耐藥性,可能與本菌對人體的感染致病機制有關,也與這兩個感染部位基礎疾病對相關抗菌藥物高耐受有一定的關系。應根據相關感染部位的分布特點及耐藥情況有針對性地做好防控策略,對預防治療呼吸道、泌尿道、消化道及傷口感染等進行合理用藥。

研究顯示,將左氧氟沙星、阿米卡星與 EDTA聯合治療肺炎克雷伯菌感染,治療有效率高,加用 EDTA使細菌MIC降低,對抗菌藥物的敏感性恢復[14]。本研究結果與上述報道結果相一致,不同濃度的EDTA能夠降低多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星抗菌藥物的MIC,恢復敏感性。中濃度以及高濃度EDTA能夠顯著降低MIC。在敏感性試驗中,EDTA的抗菌作用已被證實有效,包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、酵母菌等[15]。細菌細胞膜、外膜上有親水性蛋白通道,允許通過親水性物質,有利于親水性藥物(如阿米卡星、左旋氧氟沙星)進入。針對細菌的外排泵作用,EDTA可以與Ca2+、Mg2+等維持膜結構、功能的成分絡合,導致細胞通透性、流動性增加。藥物濃度增加可以對抗降低的外膜滲透性以及藥物外排泵出增強導致的多種耐藥[16]。研究表明,EDTA對菌膜生長的抑制作用具有濃度差異,并且不同成分的EDTA、不同給藥方法對菌膜的抑制作用也存在差異性,EDTA通過破壞菌膜結構加強抗菌藥物的臨床療效。根據EDTA能恢復多重耐藥肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的敏感性,明確基本控制策略,降低多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的發生率,并為臨床治療提供重要依據,為治療多重耐藥菌開發新途徑。合理應用抗菌藥物,有利于提高患者生存質量,節省醫療費用,減輕患者家庭負擔[17-18]。

綜上所述,中、高濃度的EDTA能恢復多重耐藥肺炎克雷伯菌對哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星與左旋氧氟沙星抗菌藥物的敏感性,為治療產ESBLs多重耐藥肺炎克雷伯菌及研發新藥提供了可借鑒的方向。