差速離心法提取血小板來源的外泌體及其鑒定

陳文科，操龍斌，陳雨薇，馮杰娥

南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東佛山 528244

多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，主要分布于細(xì)胞上清液，例如血漿、血清等。外泌體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、mRNA等，因此能夠廣泛參與細(xì)胞間的物質(zhì)交換。人體正常狀態(tài)下，血液中血小板來源的微粒占據(jù)所有微粒的70%以上。近年來，成分輸血逐漸引起了醫(yī)學(xué)界的重視和關(guān)注，成為了治療腫瘤患者的重要措施，外泌體不僅在細(xì)胞間信息傳遞發(fā)揮著重要作用，而且在腫瘤治療、藥效研究等眾多領(lǐng)域具有關(guān)鍵作用[2]。對于血小板來源外泌體的提取與鑒定的研究具有重要價值，對于日后血小板的研究具有借鑒指導(dǎo)意義[3]。該次于2020年6—9月期間，方便選取實驗樣本100份展開研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測儀器

該次實驗所需的檢測儀器以及試劑:超速離心機:WX100；離心水平轉(zhuǎn)頭:SW32TI；透射電鏡:LVEM25；全能型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)；血小板震葛儀:PL-11；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒；HSP70抗體ALXI抗體。

1.2 樣本來源

方便選取該市血站2019年內(nèi)獻血志愿者捐贈的單采血小板，獻血者均符合中華人民共和國衛(wèi)生部所規(guī)定的獻血者健康標(biāo)準(zhǔn)，檢驗合格后在血小板震蕩儀上進行保存留用[4]。

1.3 樣本處理

選擇當(dāng)天采集的同一單采血小板樣本，分A、B、C、D、E共5組，3袋/組， 其中A、B組分別標(biāo)為A1、A2、A3、B1、B2、B3號。A組在血小板振蕩器上存放1 d后進行提取，B組在血小板振蕩器上震蕩存放3 d后進行提取；C、D、E組在振蕩器存放1 d，離心，C組上直接提取外泌體，D組（不加任何試劑）、E組（加入5%的DMSO）-80℃凍存3 d后提取外泌體[5]。

1.4 外泌體提取

①將震蕩的血小板裝入15 mL無菌離心管中，4℃，500 g離心力條件下離心10 min，棄沉淀；

②將上一步離心所得的上清裝入新的15 mL無菌離心管中，4℃，1 500 g離心力離心10 min，棄沉淀[6]。

③將上一步離心所得的上清液裝入新的15 mL無菌離心管中，4℃，3 200 g離心15 min，可見血小板沉淀至管底，棄上清。

④將上一步離心所得的沉淀用1 mL PBS溶液重懸，再裝入新的1 mL無菌離心管中，加入0.1 U/mL凝血酶，37℃孵育15 min，得到完全激活的血小板。

⑤將激活的血小板4℃，3 200 g離心15 min，可見血小板沉淀于離心管底，取上清[7]。

⑥將上一步離心所得的上清液放入1 mL無菌離心管中，用預(yù)冷的PBS溶液1 mLA重懸后，4℃，110 000 g離心力條件下離心90 min，棄上清后，用200 L的PBS溶液重懸，-80℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.5 外泌體鑒定

1.5.1 透射電鏡檢測外泌體形態(tài)及大小 取分離提取的外泌體各20μl重懸液于塑料薄膜上。將銅網(wǎng)狀物翻轉(zhuǎn)到液滴表面，放置10 min[9]。然后，將銅網(wǎng)狀物轉(zhuǎn)移到1%的戊二醛液滴中，液體慢慢地被濾紙吸收，用雙蒸餾水滴將銅網(wǎng)清洗3次，3 min/次，再用濾紙將銅網(wǎng)上的液體慢慢吸收，此時液體不能完全吸收干凈，對此使用白熾燈照射10 min。等銅網(wǎng)充分干燥時將銅網(wǎng)轉(zhuǎn)移到樣品區(qū)，并在80 kV透射電子顯微鏡下觀察[10]。

1.5.2 免疫印跡法驗證 首先，選取之前分離備好的外泌體20μl，兩管分別加入體積相同的RIPA細(xì)胞裂解液(含1%PMSF)，裂解30 min后進行離心操作，時長5 min。隨后取適量上清液加人適量的4×蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min。取處理后外泌體樣本各10μl于12%SDS-PAGE凝膠上電泳,結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,采用200 mA的恒定電流，轉(zhuǎn)膜80 min[11]。轉(zhuǎn)膜結(jié)東后，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,再加入HSP70抗體ALXI抗體一抗。搖床上孵育1 h，再TBST洗膜4次,每次清洗4 min加二抗，最后在膜上加入適量ECL化學(xué)發(fā)光液，并用全能型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析即可。

1.5.3 外泌體總蛋白濃度測定 取分離提取的外泌體各20μl，并分別加入20μl RIPA細(xì)胞裂解液(含1%PMSF)，冰上裂解30 min,1 000 rpm離心5 min；分別取25μl新鮮配置的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和處理后外泌體樣本,加入到96孔板中；再每孔加入200μl新鮮配置的BCA工作液；加蓋,37C孵育30 min，在562 nm處檢測各孔的吸光度值后換算。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡下外泌體的形態(tài)

隨著保存時間的增加，單采血小板來源外泌體的含量也在增加。見圖1。

圖1 透射電鏡下血小板源外泌體的形態(tài)

2.2 外泌體免疫印跡法驗證結(jié)果

血小板來源外泌體蛋白標(biāo)志驗證。見圖2。

圖2 血小板源外泌體蛋白標(biāo)志驗證

2.3 不同保存時間對單采血小板來源外泌體的蛋白濃度的影響

實驗樣本100份。存放3 d的血小板源外泌體蛋白質(zhì)的濃度為（1 096.1±10.5）μg/mL，存放1 d的的血小板源外泌體蛋白質(zhì)的濃度為（709.5±9.5）μg/mL，存放時間長的血小板來源外泌體的蛋白質(zhì)濃度明顯高于存放天數(shù)短的。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=273.030，P＜0.001)，見圖3。未凍存組蛋白濃度(1 820.1±10.5)μg/mL明顯高于不含DMSO凍存組(1 155.3±2.5)μg/mL和含5%DMSO凍存組(1 402.5±6.2)μg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=615.930、342.470，P＜0.05），見圖4。

圖3 不同保存時間的血小板源外泌體總蛋白提取量

圖4 不同樣本保存方式下血小板源外泌體總蛋白提取量

3 討論

外泌體的提取方式有許多，其中超速離心法提取物的提取純度比較大，提取量可觀，同時便于操作且成本低廉，因此該研究采用超速離心法進行提取，對于影響單采血小板來源外泌體的影響因素進行了探討，其他方式不予探究。

在外泌體的提取過程中，處理提取純度，提取量也是關(guān)鍵問題。在該次實驗中，首先研究了不同存放時間對于血小板來源外泌液的影響，實驗結(jié)果得存放3 d的血小板源外泌體蛋白質(zhì)的濃度為 （1 096.1±10.5）μg/mL，存放1 d的的血小板源外泌體蛋白質(zhì)的濃度為（709.5±9.5）μg/mL，顯示存放1 d的單采血小板的外泌液濃度明顯低于存放3 d的（P＜0.05）。程驍赪等人[11]研究結(jié)果顯示存放3 d的血小板源外泌體蛋白質(zhì)的濃度為（1 100.4土9.6）μg/mL，存放1 d的的血小板源外泌體蛋白質(zhì)的濃度為（707.3±9.6）μg/mL。表明實驗結(jié)果較為準(zhǔn)確。這是由于在存放過程中，血小板不斷釋放外泌液。也就是隨著存放時間的增加，血小板活化增加，釋放的微粒也隨之增加[12]。

在醫(yī)學(xué)操作中，所有樣本不可能做到取樣后直接完全采取使用，因此凍存樣本是必不可少的過程，但是目前還沒有關(guān)于凍存對樣品的影響相關(guān)方面的報道。所以，在該次研究中進行了關(guān)于冷凍條件對外泌液提取產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果表明，經(jīng)過冷凍處理的樣本其外泌體提取產(chǎn)量會明顯少于冷凍之前。其原因是冷凍后融化會導(dǎo)致外泌體破裂，超速離心法又難以得到破碎后的外泌體，使得提取產(chǎn)量嚴(yán)重較少。細(xì)胞凍存是細(xì)胞培養(yǎng)、引種、保種和保證實驗順利進行的重要技術(shù)手段。DMSO是一種常見的細(xì)胞凍存液的組成成分，DMSO在4℃時對細(xì)胞無明顯毒性，分子量小、溶解度大、易透過細(xì)胞膜，降低細(xì)胞外未結(jié)冰溶液中溶質(zhì)濃度，使細(xì)胞免受高濃度溶質(zhì)的損傷,細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮；DMSO與水分子結(jié)合，可使冰點下降，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶損傷。在該次研究中加入5%的DMSO能夠有效保護細(xì)胞，提升血小板分泌液提取物產(chǎn)量。

綜上所述，樣本保存時間越長，外泌體的提取量越多；冷存處理會降低外泌體的提取量，而DMSO能夠有效保護細(xì)胞。該次研究對于血小板來源外泌體提取與鑒定的影響因素做出了指示，為日后線管工作的開展指明了道路。