干酪乳桿菌對酒精依賴大鼠戒斷反應的影響

肖倩倩 楊婕 羊大儒 嚴憬 韓業盛 李宗慧

摘要：目的：研究干酪乳桿菌對酒精依賴大鼠酒精戒斷反應及復飲酒量的影響，從而深入探究在酒精依賴過程中干酪乳桿菌介導的酒精戒除作用。方法：健康雄性大鼠35只，所有大鼠適應性飼養一周后給予含酒精6%（V/V）的水溶液（下同），水溶液作為唯一水源24 h自由飲用，建立酒精依賴大鼠模型，建模5周后，隨機選取造模成功的28只大鼠，隨機分為模型對照組（A組），干酪乳桿菌低劑量組（B組）和干酪乳桿菌高劑量組（C組），安定水溶液陽性對照組（D組）。再通過灌胃給藥的方式進行干預，A組大鼠灌胃普通飲用水，B、C組大鼠分別給予干酪乳桿菌4×108 CFU/（kg·d）和8×108 CFU/（kg·d），D組大鼠給予1.6 mg/kg安定水溶液，干預時間為6周，同時A、B、C、D組大鼠每隔三天給予酒精水溶液維持其酒精依賴并觀察其酒精水溶液飲用量。觀察各組大鼠在每次撤除酒精后酒精戒斷綜合征（通過酒精戒斷評分表對刻板行為、激惹性、尾巴強直、異常姿勢進行評分）、大鼠在曠場試驗箱5 min內中央區所待時間、站立次數比較。結果：干酪乳桿菌干預的B、C組大鼠酒精戒斷癥狀較模型對照組有明顯差異（P<0.05），再次飲酒量也相比模型對照組顯著降低，其探究行為（站立次數）和水平動機活度（中央區時間）與模型對照組比較，無顯著差異（P>0.05）。結論：干酪乳桿菌對酒精依賴大鼠行為可能存在影響，進而改善酒精成癮相關癥狀，為酒精成癮治療和戒斷提供新方向。

關鍵詞：干酪乳桿菌;酒精依賴大鼠;酒精戒斷反應;腸道菌群;曠場試驗

酒精依賴癥是指大劑量長期飲酒使得機體對酒精產生了心理和生理上的隱癖[1]。臨床表現為強烈和強制的飲酒渴求，停止飲酒時可見酒精戒斷綜合征，主要表現為焦慮、煩躁、抑郁、心悸甚至震顫等戒斷癥狀。近年來發現腸道微生物可能在酒精依賴發生發展中起到重要作用。腸道微生物參與調節免疫系統、代謝內分泌和中樞神經遞質及相應受體功能[2～4]。研究腸道菌群在調控酒精依賴過程的機制，對于進一步揭示酒精依賴的成癮機理，及找到新的治療靶點具有重要意義。吳艷艷等[6]實驗中，干酪乳桿菌干預后大鼠的憂郁行為明顯改善，能影響大鼠神經系統，調節腸道菌群。本研究參照Turchan J[5]等學者的方法建立酒精成癮大鼠模型，選用益生菌中干酪乳桿菌作為干預物，參照改良柳田知司評分表、曠場實驗，初步研究干酪乳桿菌對酒精依賴大鼠戒斷反應的影響。現報道如下：

1材料與儀器

1.1 實驗動物

35只清潔級健康雄性大鼠，體質量（220±10）g，由長沙天勤生物技術有限公司提供。

1.2 實驗藥品

白酒從正規商場購買，干酪乳桿菌菌株由廣東環凱微生物科技有限公司提供，安定片由海南省第一附屬醫院提供。

1.3 實驗儀器

曠場反應箱。

2實驗方法

2.1 制備酒精依賴大鼠模型

模型的制備參照Turchan J等[5]方法。具體方法：模型組大鼠的飲水換成含6%（v/v）乙醇的水溶液，24 h自由進食，每天9：00AM配置酒精溶液，連續飲用5 w，按照酒精戒斷癥狀評分表分別于停止飲用酒精4 h、6 h、24 h進行評分，選取與正常大鼠酒精戒斷癥狀評分有顯著差別的大鼠納入實驗組。

2.3 干酪乳酸桿菌的制備

于廣州環凱微生物有限公司購買凍干粉形式的干酪乳桿菌活化培養，37℃，MRS培養基。

2.4 動物分組與給藥

取造模成功的大鼠28只隨機分組，分為模型對照組、低、高濃度干酪乳桿菌組及陽性對照組共4組，每組7只。每日分別給予普通飲用水、4×108 CFU/（kg·d）、8×108 CFU/（kg·d）及安定水溶液1.6 mg/kg給予實驗組大鼠灌胃給藥。給藥其間每3 d測一次體質量，并隨著大鼠體質量變化調整給藥量，一共給藥6周。所有大鼠均以普通飼料喂養，并自由飲水，每隔3 d給予1次酒精干預，記錄飲酒量。

2.5 酒精戒斷癥狀評分

將停止飲用酒精水溶液后6 h大鼠置入檢測箱，同時攝像并記錄5 min大鼠的自發性刻板行為、激惹性、尾巴強直及異常步態，每個項目按癥狀出現頻率和輕重程度分為1～4級，4個項目相加即為總分，總分越高戒斷癥狀越嚴重。

2.6 曠場實驗

曠場試驗反映動物動機行為。將大鼠放置在曠場中心內，觀察10 min，記錄后5 min內動物爬格數，以動物多于1/3的身體超過線而在不同的格子內為過線，爬過一格得1分;動物站立次數，以動物雙前腿起，重量全在后腿上為站立，站立一次為1分。

3統計學方法

采用SPSS25.0統計學軟件分析處理數據，實驗結果以（±s）表示。

4結果

4.1 造模情況

大鼠連續飲用酒精水溶液28 d后大部分大鼠造模成功，與造模前酒精戒斷癥狀評分有顯著差異。

4.2 灌胃干預后大鼠酒精戒斷癥狀變化

給藥前各組大鼠酒精戒斷癥狀評分比較，無明顯差異。于第三周時B、C組大鼠酒精戒斷癥狀評分開始與A組有明顯差異，D組大鼠第二周時酒精戒斷癥狀評分即有明顯差異，于第五周時B、C組大鼠酒精戒斷癥狀評分下降明顯。

4.3 曠場實驗

干預前后其行為學未見明顯差異。

4.4 飲酒量變化

在干預前各組飲酒量無明顯差異，干預后不同時間單位干預下A組飲酒量（X=155.6 ml）明顯高于C組（X=116.2 ml）、D組（X=136.7 ml）飲酒量。

5討論

本研究采用含6%酒精水溶液作為唯一飲水源，建立穩定的酒精依賴大鼠模型。模擬人類酒精戒斷過程。本研究結果顯示，給予灌胃低、高濃度干酪乳桿菌的酒精依賴大鼠，其酒精戒斷癥狀評分明顯低于對照組;與安定水溶液組相比，高濃度干酪乳桿菌與其酒精戒斷癥狀評分無顯著差異;而再次給高濃度干酪乳桿菌組酒精水溶液時其飲酒量明顯低于對照組，相比于安定組，其飲酒量也較低。說明干酪乳桿菌能明顯改善酒精依賴大鼠的酒精戒斷癥狀，其效與安定水溶液類似。但對大鼠再次飲酒量有明顯降低作用，其效果明顯優于安定水溶液。表明干酪乳桿菌對酒精依賴大鼠的酒精戒斷癥狀有明顯改善作用，并可減少再次飲酒時的飲酒量。可能是與干酪乳桿菌可影響酒精依賴相關神經遞質，及調節下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸），并影響某些炎癥介質有關。有研究顯示，酒精攝入后可引起多巴胺、五羥色胺的濃度改變，從而改變大腦興奮性，引起焦慮抑郁情緒和沖動性增強 ，而人體腸道可分泌多種神經遞質，在5-HT、GABA和多巴胺合成發揮重要作用，干酪乳桿菌可能通過這種機制影響神經遞質合成，從而影響酒精依賴大鼠的行為。目前，酒精依賴患者停止飲酒出現焦慮抑郁等戒斷癥狀，成為臨床酒精戒斷的一大阻力，多采用苯二氮卓類藥物用于緩解臨床癥狀減輕其焦慮情緒，但其副作用及成癮性成為其一大弊端。而干酪乳桿菌作為一種益生菌對酒精依賴患者并無副作用，能調節腸道微生態而改善酒精戒斷癥狀，這為腸道菌群介導的酒精依賴深入研究及治療酒精戒斷癥狀的新藥提供了新的方向。

參考文獻

[1]郝偉.酒精相關障礙的診斷與治療指南[M].北京：人民衛生出版社，2014：2-8.

[2]Wei-Hsien Liu，Hsiao-Li Chuang，Yen-Te Huang，et.a1 Alteration of behavior and monoamine levels attributable to Laetobaeillus Plantarum PS128 in germ-free mice [J].Behav Brain Res，2016，298（PtB）：202-209.

[3]Dinan T G，Stanton C，Cryan J F.Psyehobiotics：a novel class of PsychotroPic[J].Biol Psychiatry，2013，74（10）：720-726.

[4]Clarke G，Grenham S，Scully P，et a1.The microbiome-gut-brain axis during early life regulates the hiPPocamPal serotonergic system in asex-dePendent manner[J].Mol Psychiatry，2013，18（6）：666-673.

[5]Canicella S，Ron D，Barak S.Intermittent ethanol access schedule in rats as a Preclinical model of alcohol abuse[J].Alcohol，2014，48（3）：243-252.

[6]汪冠豪，鄭璐璐，許東坡，等.腸道菌群功能與成癮機制的研究進展[J].微生物學雜志，2018，38（4）：105-113.