沙棘總酚酸對胃癌細(xì)胞MGC-803增殖、遷移和細(xì)胞周期的影響

趙 陽，王海生

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

沙棘是一種落葉性灌木，屬胡頹子科，又名為黑刺、醋柳、酸棘。它是一種耐旱耐寒植物[1]。我國是世界上沙棘種植面積最大，品種最多的國家，在我國主要分布在華北，西北等地區(qū)[2]。沙棘不僅有水土保持的作用，而且具有很高的藥用價值。沙棘是一種藥食兩用植物，它含有許多生物活性物質(zhì)，包括維生素、不飽和脂肪酸、酚類化合物、類黃酮等[3]。其主要活性成分是酚酸類化合物，其中總酚酸在抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等方面效果顯著[4]。

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍排第四[5]。胃癌是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，亦是我國癌癥死亡的主要原因之一[6～8]。目前，胃癌的治療方法主要包括手術(shù)和化療[9，10]，但效果往往不甚理想。因此尋找一種能夠有效治療或者控制胃癌并改善患者預(yù)后的藥物，具有重要意義。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對于沙棘總酚酸治療胃癌的研究目前尚未見報道。因此本研究通過觀察沙棘總酚酸對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，嘗試探索其對胃癌的作用及機(jī)制，從而為沙棘的實(shí)驗(yàn)研究提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沙棘總酚酸的提取

準(zhǔn)確稱量沙棘果1g，搗碎后加入25mL70%乙醇，加熱回流1h，冷卻，過濾，之后再加入30mL70%的乙醇，重復(fù)以上步驟，最后收集在100 mL量瓶中，用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇清洗殘留后收集，再加一定量的70%的乙醇達(dá)到100mL，混合均勻，測定含量。

1.2 細(xì)胞

MGC-803細(xì)胞由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供

1.3 主要試劑

胎牛血清、RPMI-1640、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶（含酚紅和0.25%EDTA）購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，4%多聚甲醛、結(jié)晶紫購自北京Solarbio公司，transwell小室購自美國corning公司，DNA含量檢測試劑盒（細(xì)胞周期），總RNA提取試劑盒購自北京天根，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物，qPCR試劑盒購自日本toyobo。

1.4 主要儀器

超凈工作臺（美國Thermo），恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo），低速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳），倒置顯微鏡（德國Leica），流式細(xì)胞儀（美國beckman），酶標(biāo)儀（美國perkin elmer），熒光定量PCR儀（美國ThermoPikoReal）。

2 方法

2.1 CCK-8方法

取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞消化重懸為3×104個/mL，分別在三個96孔板均勻加入100μL，設(shè)空白調(diào)零組，陰性對照組和沙棘酚酸給藥組（1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL），培養(yǎng)24h，48h，72h后，棄掉舊培養(yǎng)基，各孔中加入含10μLCCK8的培養(yǎng)基，之后將96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)，3.5h后用酶標(biāo)儀測定波長450nm處的吸光度值，計算IC50值。細(xì)胞抑制率=[（陰性對照組平均OD值－實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/（陰性對照組平均OD值-空白調(diào)零組平均OD值）]×100%。

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)法

將對數(shù)生長期的MGC-803胃癌細(xì)胞調(diào)整密度為1X10^6個/mL，上室內(nèi)200μL細(xì)胞懸液，10%血清培養(yǎng)基500μL加入下室，48h后吸去小室的培養(yǎng)基，棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)部，4%的多聚甲醛固定，之后用0.1%結(jié)晶紫染色，洗去多余結(jié)晶紫，隨機(jī)選取10個高倍視野（200倍鏡）計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)

取對數(shù)生長期的MGC-803胃癌細(xì)胞設(shè)置陰性對照組，沙棘酚酸給藥組（2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL），培養(yǎng)48h后，用PBS洗兩次，消化離心后棄上清液，用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X10^6個/mL，加500μL預(yù)冷的70%酒精，4℃冰箱固定過夜。次日離心5min，棄上清，加入100μLRNase A，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，30min后加入400μL PI熒光染料混勻，在4℃冰箱避光放置30min，流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 qRT-PCR技術(shù)

TRIzol法提取總RNA，性質(zhì)穩(wěn)定的cDNA由RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR檢測目的基因相對GAPDH表達(dá)水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：預(yù)變性95℃，30s；變性95℃，5s；退火55℃，10s；延伸72℃，15s；40個循環(huán)；融解曲線55℃～95℃。引物序列（見表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙棘酚酸對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的沙棘酚酸分別處理胃癌MGC-803細(xì)胞24h、48h、72h后，與對照組相比，處理組的MGC-803細(xì)胞增殖受到明顯抑制作用，并且抑制效果呈時間-劑量依賴性。不同濃度沙棘酚酸組作用于72h時，與對照組比較，5mg/mL和6mg/mL沙棘酚酸組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，細(xì)胞生長被顯著抑制。經(jīng)GraphPad Prism 6軟件計算，沙棘酚酸作用細(xì)胞24h、48h、72h的IC50值分別為4.893mg/mL、4.311mg/mL、4.106mg/mL（見圖1）。考慮到IC50值及細(xì)胞毒性作用，選用2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 沙棘總酚酸對MGC-803細(xì)胞抑制率的影響Fig.1 Effect of total phenolic acid of sea-buckthorn on inhibition rate of MGC-803 cells

3.2 沙棘酚酸對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙棘酚酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞48h后，與對照組相比，三個處理組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且沙棘酚酸對MGC-803細(xì)胞遷移能力的抑制作用呈濃度依賴性（見圖2）。

圖2 Transwell小室中細(xì)胞結(jié)晶紫染色圖（x200）以及細(xì)胞遷移數(shù)的柱狀圖：a表示0mg/mL；b表示2mg/mL；c表示3mg/mL；d表示4mg/mLFig.2 Crystal violet staining of cells in Transwell chamber(X200)and the histogramof cell migration number:a 0mg/mL；b 2mg/mL;c 3mg/mL；d 4 mg/mL

3.3 沙棘酚酸對胃癌細(xì)胞周期的影響

沙棘酚酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞48h后，與對照組相比，三個處理組G0/G1期和S期的細(xì)胞比例顯著降低，而G2/M期的細(xì)胞比例顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且沙棘酚酸對MGC-803細(xì)胞周期的抑制作用呈濃度依賴性。結(jié)果表明，沙棘酚酸對胃癌MGC-803細(xì)胞的的周期有顯著抑制作用，能將其阻滯于G2/M期（見圖3、4）。

圖3 沙棘總酚酸對細(xì)胞各周期影響的流式直方圖：a表示0mg/mL；b表示2mg/mL；c表示3mg/mL；d表示4mg/mLFig.3 Flow histogram of the influence of total phenolic acid of seabuckthorn on each cell cycle:a 0mg/mL；b 2mg/mL；c 3 mg/mL；d 4 mg/mL

3.4 qRT-PCR結(jié)果顯示

沙棘酚酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞48h，各目的基 因的2-ΔΔCT值 分 別為E-cadherin（0.42±0.05）、Gsk-3β（0.10±0.01）、SFRP（5.78±0.37），與對照組比較，SFRP是對照組的（5.78±0.37）倍，SFRP基因被上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，E-cadherin和Gsk-3β基因表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖5）。

圖5 加藥前后各目的基因的2-ΔΔCT值柱狀圖Fig.5 The purpose gene 2-before and after the dosingΔΔCT value histogram

圖4 不同濃度沙棘總酚酸對胃癌細(xì)胞MGC-803各周期的影響Fig.4 Effects of different concentrations of seabuckthorn total phenolic acid on each cycle of MGC-803 in gastric cancer cells

表2 不同組中各目的基因的相對表達(dá)量（±s）Tab.2 Relative expression levels of each target gene in different groups（±s）

表2 不同組中各目的基因的相對表達(dá)量（±s）Tab.2 Relative expression levels of each target gene in different groups（±s）

沙棘總酚酸濃度（mg/mL）目的基因ΔCT值（images/BZ_18_570_715_591_745.png±s）E-cadsin 18.93±0.06 20.21±0.24 0 4 GSK-3β 9.91±0.21 13.23±0.13 SFRP 23.87±0.22 21.34±0.13

4 討論

胃癌是一種發(fā)病率高，死亡率高的惡性疾病[11]。目前臨床治療以手術(shù)結(jié)合化療為主，副作用大，效果有限[12，13]。隨著中草藥抗腫瘤作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)部分中草藥中的活性成分對腫瘤具有很好的抑制作用，對抗腫瘤藥物的研究具有重要價值。總酚酸作為沙棘中一種有效的抗腫瘤活性成分，現(xiàn)有文獻(xiàn)中對其抗腫瘤研究相對較少，因此本研究通過觀察沙棘總酚酸對Wnt／β-catenin的異常激活是已知的人類癌癥中常見的異常信號調(diào)節(jié)通路，因此，有必要探索該信號通路中的靶位點(diǎn)并尋找相應(yīng)的有效作用物，以抑制癌細(xì)胞中Wnt通路的異常活化，從而為癌癥治療提供一種可能。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑是一類傳導(dǎo)生長刺激信號的通路，由細(xì)胞外的Wnt蛋白、膜受體Frizzled、胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin及下游的轉(zhuǎn)錄因子組成[14]。βcatenin可與E-cadherin胞內(nèi)區(qū)結(jié)合形成P-catenin/E-cadherin復(fù)合體，再與肌動蛋白骨架相連，減弱細(xì)胞間黏附，誘導(dǎo)腫瘤的EMT過程從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[15]。GSK-3β通過抑制βcatenin蛋白來抑制癌細(xì)胞的增殖。SFRP屬于分泌型糖蛋白，與Wnt結(jié)合，從而競爭性抑制Wnt與Frz／LRP受體結(jié)合，而阻遏信號通路的傳導(dǎo)。

細(xì)胞周期失調(diào)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]，細(xì)胞周期由四個有序和嚴(yán)密的調(diào)控階段組成（稱為G1、S、G2和M）。DNA合成（S期）是兩個子細(xì)胞的分離，M期是主要的細(xì)胞周期進(jìn)展，S期之前的周期是G1期，為這些細(xì)胞準(zhǔn)備DNA合成。正常的細(xì)胞周期如果失去調(diào)控，則會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖[17，18]。

本研究以人胃癌MGC-803細(xì)胞為研究對象，檢測并研究沙棘酚酸對胃癌細(xì)胞增殖，遷移和周期的影響及機(jī)制，為沙棘酚酸抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙棘酚酸作用于胃癌MGC-803，隨著沙棘酚酸濃度的升高，MGC-803細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱，說明沙棘酚酸對于MGC-803細(xì)胞的生長具有抑制作用。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙棘酚酸將胃癌細(xì)胞阻滯在G2/M期。說明沙棘酚酸對胃癌MGC-803細(xì)胞的周期具有抑制作用。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沙棘酚酸抑制胃癌MGC-803的遷移并呈濃度依賴性，為了探討可能的機(jī)制，本研究測定了相關(guān)基因E-cadherin、GSK-3β和SFRP的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)沙棘酚酸下調(diào)E-cadherin、GSK-3β，上調(diào)SFRP。

綜上所述，沙棘酚酸在胃癌中具有抗腫瘤效應(yīng)，能夠抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖且呈濃度依賴性，沙棘酚酸還可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動，并阻滯細(xì)胞周期在G2/M期，調(diào)節(jié)Wnt/β－catenin信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。沙棘酚酸安全性高，且可有效抑制胃癌細(xì)胞生長，可為將來臨床治療胃癌，尤其是進(jìn)展期胃癌及化療藥物效果不好的患者提供新的治療方向。