非小細胞肺癌HIF-1α和CA9表達與PET-CT SUV max的相關性及其對預后的影響

王立紅，呂秀云，白 俠，康世榮，所 鴻，徐 鵬，楊 婷

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院核醫學科；3.內蒙古醫科大學附屬醫院胸外科）

乏氧微環境通過復雜機制參與腫瘤的發生發展，并與不良預后密切相關，也是腫瘤對放化療、免疫治療、靶向治療等多種抗癌療法產生抵抗的重要因素[1]。因此，乏氧檢測對腫瘤研究有著重要的意義。乏氧誘導因子-1（hypoxia-inducedfactor-1，HIF-1）是細胞在乏氧應激時產生的轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成，誘導參與細胞增殖、凋亡、糖代謝、pH調節和血管生成的多個基因的表達上調，其中HIF-1α在腫瘤發展過程中起到至關重要的作用[2]。一種膜相關的含鋅金屬酶是碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9），它在腫瘤酸堿平衡中發揮關鍵作用，且有利于腫瘤細胞在酸性微環境中生存，增強了其遷移、侵襲和轉移的能力[3]，在各種人類腫瘤中過度表達，并與預后和治療效果相關。本研究采用免疫組化方法分析NSCLC原發灶組織中HIF-1α、CA9的表達與PET-CT SUV max值的相關性及其對病人預后的一些影響。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇

2015-10～2017-12內蒙古醫科大學附屬醫院45例經活檢病理診斷的NSCLC病人，于胸外科進行手術切除治療，術式為肺葉切除術+淋巴結清掃術，術前未接受任何抗腫瘤治療。病理切片由2名有經驗的病理醫師作出診斷。45例病人中，男病人29例，女病人16例，平均年齡為59.1歲，其中鱗癌有17例，腺癌有28例，IA期有31例，IB期有6例，IIA期有3例，IIB期有5例，腫瘤直徑（22.80±13.04）mm。術后I期病人均無其他輔助抗腫瘤治療，II期的8例病人中有6例完成4周期含鉑兩藥化療方案，有2例未進行化療。

1.2 病理免疫檢測

1.2.1 主要試劑HIF-1α抗體，CA9抗體；FITC標記IgG，HRP標記IgG。

1.2.2 實驗方法腫瘤石蠟包埋標本以3μm層厚連續切片，每例標本先進行HE染色作為對照并作形態學判定。采用間接免疫熒光組織化學和免疫酶組織化學染色方法。HIF-1α，CA9一抗以1：100稀釋，熒光二抗和HRP二抗以1：300稀釋。切片經烤片、脫蠟、微波抗原修復后孵育一抗、二抗。陰性對照：參照HE染色切片，以同一切片內的正常組織細胞作為陰性內對照。空白對照：以PBS緩沖液代替一抗工作液。陽性對照：以試劑公司提供的陽性結果圖片作為參照。

1.2.3 結果判讀免疫熒光組織化學染色以細胞核為藍色熒光，CA9陽性著色為細胞膜呈現綠色熒光，HIF-1α陽性著色為細胞核呈現綠色熒光。免疫酶組織化學染色定量分析：HIF-1α以細胞核著色為陽性標記，CA9以細胞膜著色為陽性標記，陽性著色為棕黃色，采用半定量分析方法測定陽性細胞百分比：每組內每個因子每張切片隨機挑選不得少于5個200倍視野進行拍照，拍照時要讓組織充滿整個視野，計算陽性細胞百分比（陽性細胞數/總細胞數×100%），參照Baardwijk等人的判讀方法[4]，陽性細胞百分比≥25%判斷為陽性。

1.3 PET-CT檢查

檢查前病人禁食6h以上，血糖＜6mmol/L，靜脈注射18F-FDG，由2名以上核醫學醫師對肺癌病灶進行分析。

1.4 術后定期復查隨訪

病人術后第1年要每3個月復查一次、第2年要每6個月復查一次，第3年及以后要每年復查一次，復查內容有常規體格檢查、胸部CT、腹部增強CT、頭顱核磁、骨掃描，淺表淋巴結彩超等。隨訪時間與病人復查時間同步，隨訪截止時間為2019-12-31，發生復發、轉移事件后隨訪不終止，發生死亡事件時隨訪終止。隨訪內容包括上述檢查結果，通過查閱病人門診、住院病歷資料以及電話聯系方式進行隨訪。用無病生存期DFS評估預后，DFS定義為自手術之日起，至出現腫瘤復發、轉移、與腫瘤相關的死亡的時間。

1.5 統計學處理

應用SPSS 16.0統計軟件進行分析。采用χ2檢驗分析各因子表達水平與臨床特征的相關性，對于連續數據，不同組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線圖像，并進行Log-rank檢驗，在單因素分析中P＜0.05的因素可進入多因素回歸分析；相關性分析采用Pearson分析，所有檢驗均為雙側，檢驗水準為α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料及隨訪結果

45例病人平均隨訪時間35個月（8～51個月），中位隨訪時間36個月，失訪0人，最后1次隨訪時存活42人。45例中共計8例復發（包括轉移、死亡病例），其中I期3例均存活，II期復發5例中有3例死亡。45例病人平均DFS 33個月，3年OS 93%。術前腫瘤原發灶直徑＞32.5mm組病人DFS較差（P＜0.001）（見圖1），臨床分期II期組的病人DFS較差（P＜0.001）（見圖2）；單因素線性回歸顯示腫瘤直徑、腫瘤分期與DFS呈負相關（P＜0.001）（見表5），病理類型、年齡、性別與DFS無明顯相關性（P=0.08，P=0.07，P=0.17）；多因素分析中腫瘤直徑與DFS呈負相關，是早期NSCLC根治術后病人預后不良的獨立危險因素（P=0.003）。

圖1 腫瘤原發灶直徑（mm）與無病生存期

圖2 腫瘤臨床分期與病人無病生存期

2.2 PET-CT SUV max結果

45例病人PET-CT SUV max均數6.95，中位數6.17，生存曲線示SUV＞9.2組病人DFS低于SUV≤9.2組（P＜0.001）（見圖3），兩組平均DFS為16.9個月vs 37.1個月。SUV max＞9.2組3年OS率66.7%，3年DFS 33.3%；SUV max≤9.2組3年OS 100%，3年DFS 94.4%。復發病人共8例中有6例SUV max＞9.2，其中3例為死亡病例。單因素線性回歸分析顯示SUV max與DFS呈顯著負相關（P＜0.001）（見表5），多因素回歸分析顯示SUV max是早期NSCLC根治術后病人預后不良的獨立危險因素（P＜0.001）（見表6）。

圖3 SUV max與病人DFS

2.3 免疫組織化學染色結果（見圖4、5）

圖4 NSCLC組織CA9免疫組化結果 染色陽性為癌細胞胞膜呈棕黃色（200x）

（1）本研究HIF-1α陽性表達有27例（60%），其中腺癌有13例，鱗癌有14例，CA9陽性表達有21例（46.7%），其中腺癌有9例，鱗癌有12例，HIF-1α、CA9共表達。20例（44.4%），二者在內對照及空白對照組中表達均為陰性。χ2檢驗、t檢驗結果顯示HIF-1α的陽性表達與性別及病理類型有關（P=0.022，P=0.017）（見表1、2），不受病人年齡、腫瘤分期、腫瘤直徑的影響（P＞0.05），HIF-1α在鱗癌中陽性表達率82.4%，在腺癌中陽性表達率46.4%；CA9表達與性別、病理類型、臨床分期、腫瘤直徑有關（P＜0.05），不受年齡影響（P＞0.05），在鱗癌中陽性表達70.6%，在腺癌中表達32.1%（見表1、3）；（2）HIF-1α、CA9、SUV max之間的相互關系：Pearson相關性分析顯示HIF-1α和CA9的表達具有相關性（r=0.693，P＜0.001），HIF-1α與SUV max具有相關性（r=0.783，P＜0.001），CA9表達與SUV max具有相關性（r=0.793，P＜0.001）（見表4）；（3）HIF-1α、CA9與DFS：單因素線性回歸分析顯示HIF-1α、CA9表達與病人DFS呈負相關（P＜0.001）（見表5）。多因素分析顯示HIF-1α、CA9表達不是NSCLC病人預后不良的獨立危險因素（P=0.72，P=0.14）（見表6）。

表1 HIF-1α、CA9與臨床特征的關系

表4 HIF-1α、CA9、SUV max Pearson相關性分析

表5 單因素線性回歸分析

表6 多因素回歸分析

3 討論

在臨床實踐中，18F-FDG PET-CT成像常被用于惡性腫瘤的診斷、分期、治療計劃和治療反應監測，腫瘤FDG攝取是肺癌病人預后的重要影響因素[5]。本研究由于納入樣本量較少，且研究對象為早期病人，隨訪時間短，3年總體生存率高達93%，所以在生存分析中我們通過DFS評判病人預后，根據ROC確立的SUV max的cut off值為9.2，以此分為高低兩組病人，生存曲線示兩組病人的DFS差異具是有統計學意義的（P＜0.001），＞9.2組病人平均DFS為16.9個月，而≤9.2組病人平均DFS為37.1個月；在單因素分析中SUV max值與DFS呈顯著負相關（P＜0.001），多因素分析結果顯示SUV max是病人的獨立預后因素（P＜0.001），與大部分的研究結果相符[6]，本研究顯示SUV max升高提示NSCLC病人預后不良。

圖5 NSCLC組織HIF1α免疫組化結果 染色陽性為癌細胞胞核呈棕褐色（200x）

表2 HIF-1α與腫瘤直徑、年齡的關系

表3 CA9與腫瘤直徑、年齡的關系

18F-FDG攝取作為一種乏氧檢測方法，其基本原理是乏氧可增加癌細胞葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的表達，使葡萄糖氧化向糖酵解方向轉變，FDG通過葡萄糖轉運體進入腫瘤細胞后，在胞漿中積累，因此PET成像可直接反映腫瘤細胞的葡萄糖代謝活性，識別高代謝的腫瘤亞單位，這些單位更容易局部復發。Pugachev等人發現FDG攝取與腫瘤組織乏氧標記物染色呈正相關[7]，我們的研究也顯示HIF-1α、CA9的表達量與SUV max呈正相關（r=0.783，P＜0.001）（r=0.793，P＜0.001）。乏氧微環境是肺癌耐藥、預后差的重要原因之一，而SUV max與乏氧標記物HIF-1α、CA9的表達呈正相關，這也進一步印證了SUV max對NSCLC病人預后評估的價值，同時證明了PET-CT在腫瘤乏氧檢測中的價值。

HIF-1α、CA9是肺癌發生發展過程中的重要分子事件，它們的表達與血管生成、細胞增殖、凋亡抑制、細胞粘附破壞的蛋白的表達都有相關性。HIF-1α、CA9在肺癌中表達情況的相關研究較多，大部分都得出了它們與肺癌病人不良預后的相關性[8～11]。本研究中HIF-1α陽性有27例（60%）、CA9陽性有21例（46.7%），二者表達呈正相關（r=0.693，P＜0.001），單因素分析顯示HIF-1α、CA9與病人DFS呈負相關（P＜0.001），而多因素分析顯示HIF-1α、CA9并不是病人預后不良的獨立危險因素。筆者認為HIF-1α、CA9在單因素分析中的結果可能與其他因素協同，比如，我們在對臨床資料的分析中發現CA9陽性表達組腫瘤直徑較大（28.60 vs 17.73mm），CA9表達與腫瘤直徑呈正相關（t=2.996，P=0.005），而腫瘤直徑與DFS呈負相關，所以CA9的陽性表達對于DFS的作用可能與腫瘤直徑密切相關。在免疫組化與臨床因素的關系中我們還有一些發現，HIF-1α的陽性表達與病理類型有關，在鱗癌病人中陽性表達率是82.4%，在腺癌病人中陽性率是46.4%；CA9表達與病理類型、臨床分期、腫瘤直徑都有關，在鱗癌中陽性表達率是70.6%，在腺癌中陽性表達率是32.1%。HIF-1α、CA9在鱗癌中的表達率是比較高的，提示鱗癌的乏氧情況比腺癌更嚴重，這也可以解釋鱗癌更易發生壞死的原因。CA9與腫瘤分期、腫瘤直徑的相關性進一步印證了CA9的表達與病人DFS的負相關。

HIF-1α表達的組織定位主要位于腫瘤浸潤的邊緣部分，呈彌漫性，并不局限于壞死灶，在癌細胞中表達，在間質細胞、癌旁組織也有散在表達，亞細胞定位主要在細胞核，同時也有細胞質表達。CA9表達情況與HIF-1α有所不同，其組織定位多見于腫瘤壞死周圍部分，形態呈現局灶性，沒有觀察到較大面積成片彌漫狀的表達，在間質細胞及癌旁組織幾乎無表達，其亞細胞定位主要位于細胞膜和細胞質，胞膜表達更為明顯。二者在組織中的位置分布以及表達量均有不同，這說明了HIF-1α、CA9在腫瘤中的表達除了受到乏氧直接誘導外，還各自受到其他的通路調控。我們還發現，不論是陽性病例數，還是陽性表達病人組織中的表達量，HIF-1α的表達均高于CA9，這可能是由于乏氧可誘導CA9的表達，而CA9表達在一定程度上依賴于HIF-1α通路[12]。腫瘤乏氧標記物HIF-1α、CA9表達在早期NSCLC病人中具有顯著正相關性，并與DFS呈負相關，這也提示了我們乏氧標記物可能成為惡性腫瘤的治療靶點，事實上，已有乏氧靶向抗癌藥物在一些動物實驗和臨床研究中呈現療效[13]。所以對病人的腫瘤組織進行HIF-1α、CA9檢測有助于判斷術后早期NSCLC病人的預后，為臨床實踐提供理論依據，對高表達的病人可以聯合PET-CT SUV max值，對綜合判斷預后具有重要意義。

應當承認的是，本研究有一定的局限性，樣本量較小，特別是大多數為I期病人，回顧性設計可能導致選擇或信息偏移，而且組織切片的特點并不能反映整個瘤體的情況，這也是所有病理組織實驗的共同缺點。

綜上，PET-CT SUV max是早期根治術后NSCLC病人預后不良的獨立危險因素，早期NSCLC肺癌組織中乏氧標記物HIF-1α、CA9的檢測將為腫瘤靶向治療提供新思路。PET-CT SUV max、HIF-1α、CA9三者聯合檢測可能有助于判斷早期根治術后NSCLC病人預后。