大鼠來源骨髓MSCs聯合嗅鞘細胞在大鼠脊髓損傷模型中的有效性分析

陳傳杰，朱立娟，陳佳子，于洋

（承德市中心醫院 骨科，河北 承德 067000）

0 引言

脊髓是人以及脊椎動物神經系統以及運動系統必不可少的一部分，一旦發生損傷預后較差，損傷面以下的肢體，其運動與感覺能力都將很難恢復[1]。現階段關于脊髓損傷的治療手段中，細胞移植是當下的研究熱點之一。研究人員逐漸將視線放在嗅鞘細胞(OECs)與骨髓間充質干細胞（MSCs）上。為探究在脊髓損傷中應用鼠來源骨髓MSCs聯合嗅鞘細胞治療方案的療效，本研究構建脊髓損傷大鼠模型，并將聯合培養的兩種細胞注射入大鼠體內。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本研究中心飼養的8周大SPF級SD雌性大鼠30只，體重范圍在200～300g之間。飼養在IVC獨立送風系統中，光照與黑暗按照12h的規律交替，相對濕度45%左右，室溫21℃～24℃。本研究得到醫院倫理委員會的批準。

1.2 方法

（1）大鼠脊髓損傷模型的構建：30只8周大SPF級SD雌性大鼠，采用75%乙醇對手術區域的皮膚進行消毒處理，用3%水合氯醛對大鼠進行麻醉后，將大鼠以俯臥位固定在實驗室自制的恒溫固定板上。備皮后用碘伏對大鼠背部進行消毒處理。用剪刀在背部的正中位置做一個寬約4cm的縱行切口，切開皮膚、皮下肌肉與脊柱旁的肌肉，將第九與第十胸椎椎板間的黃韌帶剪開，剔除第九胸椎的椎體與椎板，使得對應平面的脊髓暴露在視野中，使用特制的鑷子把脊髓鉗夾15s后松開鑷子，用滅菌生理鹽水對手術區域的血液進行清洗后，縫合傷口后局部涂抹抗生素防止感染[2]。

（2）提取大鼠骨髓MSCs：選擇健康的雄性8周SD大鼠，頸椎脫臼處死，用75%酒精消毒過后轉移至超凈工作臺中，分離大鼠的股骨，用PBS沖出股骨中的骨髓。離心后取沉淀物進行貼壁培養，培養條件37℃，5%CO2，顯微鏡下觀察，當細胞增殖到70%～80%時即進行傳代。加入PBS沖洗干凈培養液后，加入適量胰酶消化，當細胞恢復圓球形態后加入新鮮培養液，終止消化。低速離心后取沉淀，加入新鮮培養液，吹打混勻后分入不同的培養瓶中，繼續培養[3]。

（3）提取嗅鞘細胞：上一步中處死的大鼠，從其枕骨大孔處剖開露骨，將大腦與鼻骨去除后，暴露鼻腔，取出鼻中隔，保留近端三分之一，在解剖顯微鏡下將上皮組織剝離并清洗后分離原代細胞，經鑒定后為嗅鞘細胞的繼續培養。

（4）將骨髓間充質干細胞與嗅鞘細胞按照1∶1的比例混合培養，一周后取培養液，用ELISA法對其中的神經生長因子、神經營養因子-3的表達水平進行檢測，所用試劑盒來自上海康朗生物科技有限公司。

（5）模型制作成功后，立即在損傷處注射約5×104個細胞進行治療，對照組注射等量的PBS，模型組注射單獨的骨髓間充質干細胞，研究組注射骨髓間充質干細胞與嗅鞘細胞聯合培養的混合細胞。

（6）在術前與手術一周后應用BBB評分系統對三組大鼠的運動能力進行評估。范圍0～21分，分數越高表示大鼠的運動能力更強[4]。

1.3 觀察指標

分光光度計在450nm出測得吸光度值，借助標準曲線可計算出培養液中的神經生長因子、神經營養因子-3的表達水平。

1.4 統計學方法

收集得到的數據進行分析時使用SPSS 18.0軟件，用χ2（%）檢驗表示其中計數統計，用t檢測（）檢驗表示計量統計，若P＜0.05表明有統計學上的差異，數據可信。

2 結果

2.1 不同培養方法的神經生長因子、神經營養因子-3表達水平的對比

應用不同的培養方法，培養液中神經生長因子、神經營養因子-3表達水平的對比，差異有統計學意義（P＜0.05），但是聯合培養的培養液中這兩種物質濃度比較居中，適合向大鼠模型體內注射，見表1。

表1 不同培養方法的神經生長因子、神經營養因子-3表達水平的對比（）

表1 不同培養方法的神經生長因子、神經營養因子-3表達水平的對比（）

2.2 三組大鼠模型BBB運動能力評分的對比

手術前，三組大鼠的運動能力，組間差異無統計學意義（P＞0.05），手術后，研究組大鼠的運動能力顯著高于其他兩組大鼠，組間差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠模型BBB運動能力評分的對比（）

表2 三組大鼠模型BBB運動能力評分的對比（）

3 討論

脊髓作為中樞神經系統的重要組成部分，尤其是對成年的哺乳動物而言，受傷之后的自我恢復能力很差，脊髓受到損傷以后，其軸突的再生被抑制，因此神經功能很難得到恢復[5]。急性脊髓損傷臨床表現為肢體感覺障礙和運動功能受損。急性脊髓損傷致殘率和致死率均較高，給患者、家庭和社會帶來沉重的負擔。目前對于脊髓損傷，尚無統一治療的金標準。

嗅鞘細胞是目前治療脊髓損傷的熱門研究方向，嗅鞘細胞來源于自體組織，沒有免疫排斥反應，而且是目前發現的唯一能夠穿越中樞與周圍神經邊界的膠質細胞。嗅鞘細胞可以分泌大量不同種類的腦源性神經營養因子和支持因子，為神經細胞和軸突再生、重建連接創造良好條件。而骨髓基質干細胞在脊髓損傷中應用目前也是諸多學者的研究方向之一，MSCs在適合環境下可以分化為神經細胞，與鄰近神經組織相互作用，產生某些細胞因子（腦源性神經營養因子等），提高神經元存活率、介導軸突生長，也可以分化為血管內皮細胞和神經細胞，有利于受損區神經、血管組織修復。近些年，隨著對脊髓損傷的深入研究，人們發現多種神經營養因子的存在能夠促使受損軸突的再生[6]。故本研究通過聯合培養鼠來源骨髓MSCs和嗅鞘細胞，將兩種細胞應用于脊髓損傷大鼠。在對大鼠模型進行手術前，本研究分別對三種細胞，骨髓間充質干細胞，嗅鞘細胞，以及兩者的聯合培養，對其培養液中神經生長因子、神經營養因子-3表達水平進行檢測，以確定向模型體內注射哪種類型的細胞。結果說明，三種類型的細胞培養液中，神經生長因子、神經營養因子-3表達水平差異有統計學意義（P＜0.05），但是聯合培養的培養液中這兩種物質濃度比較居中，適合向大鼠模型體內注射。

在進行手術前，對三組大鼠模型的運動能力應用BBB評分系統進行檢測，三組大鼠的運動能力，組間差異無統計學意義（P＞0.05），手術后，研究組大鼠的運動能力顯著高于其他兩組大鼠，組間差異有統計學意義（P＜0.05），證明在本研究中采用聯合培養的方法對脊髓損傷大鼠模型的運動能力具有一定的恢復作用。

綜上所述，骨髓間充質干細胞與嗅鞘細胞聯合培養在大鼠脊髓損傷動物模型中取得了一定的療效，為進一步在脊髓損傷修復的基礎研究以及將來的臨床實驗提供了一定依據。