云南三種管鼻蝠形態(tài)特征描述及系統(tǒng)發(fā)育

張 欣 鐘韋凌 吳 毅 黃正瀾懿 Gabor CSORBA 劉 碩 王巧燕 權(quán)銳昌 李 松* 余文華*

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州，510006；2.匈牙利自然博物館動(dòng)物部，布達(dá)佩斯H-1088，匈牙利；3.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明動(dòng)物博物館，昆明，650223；4.西雙版納傣族自治州國家級自然保護(hù)區(qū)管理局科研所，景洪，666100；5.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，勐臘，666303)

管鼻蝠屬(Murina)隸屬于翼手目(Chiroptera)，蝙蝠科(Vespertilionidae)，是一類鼻孔延長呈管狀的森林型蝙蝠，主要分布在亞洲東部、南部及中部地區(qū)[1]。由于該類群常棲息于遠(yuǎn)離人煙的森林環(huán)境，飛行靈活，難以捕獲，故其本底資料較匱乏[1-3]。近20年來，通過調(diào)查強(qiáng)度的逐漸加強(qiáng)，我國管鼻蝠物種已從2007年記錄的8種[2]增加至19種，其新發(fā)現(xiàn)種類主要集中于華南和西南地區(qū)，提示我國是該類群重要的物種分化和形成場所[1，4]。

云南位于我國西南部，其熱帶雨林區(qū)域自然資源豐富，翼手目的豐富度高，是重要的生物多樣性熱點(diǎn)區(qū)域之一[5-6]。該地區(qū)蝙蝠資源非常豐富，目前已記錄翼手目種類合計(jì)7科29屬79種，但管鼻蝠屬種類僅5種[6-8]，低于相鄰國家管鼻蝠的物種數(shù)量，如：越南13種、老撾8種、泰國7種和緬甸6種[1]，也低于鄰省區(qū)，如廣西6種、貴州7種[6]，提示云南區(qū)域森林型蝙蝠本底調(diào)查仍不充分。為進(jìn)一步摸清云南西雙版納熱帶植物園哺乳動(dòng)物(Mammalia)物種多樣性狀況，于2019年對該園勐臘片區(qū)進(jìn)行哺乳動(dòng)物物種資源調(diào)查，利用蝙蝠豎琴網(wǎng)采集到管鼻蝠15只。通過外形和頭骨的形態(tài)學(xué)特征比較，數(shù)值分類學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等方法，將其鑒定為菲氏管鼻蝠(Murinafeae)、哈氏管鼻蝠(M.harrisoni)和艾氏管鼻蝠(M.eleryi)，其中前2種為云南省的新記錄。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

2019年4—5月，在中國云南省西雙版納州勐臘縣龍林新村(21°32′11″N，101°29′58″E，海拔1 024 m)等地利用蝙蝠豎琴網(wǎng)捕獲到管鼻蝠，經(jīng)鑒定包括3個(gè)物種，即菲氏管鼻蝠6只(GZHU 19167、19180、19181、19318、19320、19335)、哈氏管鼻蝠2只(GZHU 19216、19230)和艾氏管鼻蝠7只(GZHU 19168、19206、19210、19236、19311、19313、19314)，以上標(biāo)本經(jīng)外形稱量、超聲波錄制、拍照和組織取樣(體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇保存)后，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇浸泡，分別保存于廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和中國科學(xué)院昆明動(dòng)物博物館。在形態(tài)鑒定及數(shù)值分類中，本研究還使用了匈牙利自然博物館等地館藏的管鼻蝠標(biāo)本共92只，標(biāo)本信息見附錄1。

附錄1 形態(tài)特征比較使用的3種管鼻蝠標(biāo)本

1.2 標(biāo)本測量

按照哺乳動(dòng)物測量標(biāo)準(zhǔn)[4，9-10]對樣本測量(TANITA電子稱，精確到0.1 g；MNT-150數(shù)顯游標(biāo)卡尺，精確到0.01 mm)。外形測量指標(biāo)為體重(body weight，Wt)、頭體長(head and body length，HB)、前臂長(forearm length，F(xiàn)A)、耳長(ear length，E)、后足長(hindfoot length，HF)、脛骨長(tibia length，TIB)、尾長(tail length，T)。頭骨測量指標(biāo)包括顱全長(great length of skull，GTL)、枕犬長(condylo-cannine length，CCL)、腦顱寬(breadth of braincase，BB)、顴寬(zygomatic width，ZW)、眶間寬(interorbital width，IOW)、上齒列長(maxillary tooth length，C1-M3)、上犬齒寬(upper canine width，C1-C1)、上臼齒寬(third molar width，M3-M3)、下齒列長(mandibular toothrow，C1-M3)、下頜長(mandibular length，ML)。

1.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

對收集的哈氏管鼻蝠、菲氏管鼻蝠和艾氏管鼻蝠標(biāo)本形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)(表1和表2)和本次采集樣本的頭骨測量數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，使用主成分(principal component analysis，PCA)和主成分判別分析(discriminant analysis of principal components，DAPC)方法[11]，對測量數(shù)據(jù)降維分析。以上分析均在R 4.0.2中進(jìn)行[12]，使用分析軟件包包括：“psych”“ggplot2”“ade4”和“adegenet”[13-16]。

表1 3種管鼻蝠外部形態(tài)數(shù)據(jù)

表2 3種管鼻蝠頭骨數(shù)據(jù)

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

取約20 mg 肝組織使用DNA試劑盒(AG通用型基因組AG21009，艾科瑞生物)提取總DNA，之后使用PCR方法擴(kuò)增目的片段，篩選出640 bp左右的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene，COⅠ)和1 077 bp左右的核基因重組激活基因2(Recombination activating gene 2，Rag2)。線粒體COⅠ基因部分片段的擴(kuò)增引物為COⅠ-F：5′-ACA GCC TAA TAC CTA CTC GGC CAT T-3′和COⅠ-R：5′-AGG CTC GGG TGT CTA CGT CCA-3′[17]。PCR反應(yīng)總體系為30.0 μL，其中PremixTaqTM13.0 μL，引物各0.5 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O 13.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性240 s；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，37個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸240 s；4℃保存PCR產(chǎn)物。核基因Rag2基因部分片段的擴(kuò)增引物為Rag2-F：5′-GTA AGG ATT TCT TGG CAG GAG T-3′和Rag2-R：5′-ATC CTG CCC CAC TGG AGT TTT C-3′[17]，PCR反應(yīng)總體系為25.0 μL：PremixTaqTM12.5 μL；引物各1.0 μL；模板DNA 3.0 μL；ddH2O 7.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性180 s；94℃變性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸1 800 s；10℃保存PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程公司測序。

使用GENEIOUS 9.1.8軟件[18]對所得序列進(jìn)行目測校對與拼接比對。結(jié)合從NCBI-nt下載的管鼻蝠COⅠ序列(序列GenBank登錄號見附錄2)和Rag2序列，使用IQ-TREE 1.6.1軟件[19]采用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中COⅠ和Rag2序列矩陣分別根據(jù)BIC選擇最適替換模型，分別為TIM2+Г+I+G4和HKY+Г+I，自展1 000次估計(jì)節(jié)點(diǎn)的支持度。使用MrBayes 3.2[20]進(jìn)行貝葉斯樹構(gòu)建，使用MrModeltest 2.3[21]確定最佳的DNA替換模型(GTR+Γ+I)，設(shè)置參數(shù)為：建立4個(gè)馬爾可夫鏈，運(yùn)行1 000萬代，采樣頻率為5 000，丟棄前500 000代后構(gòu)建一致樹。以上分析均以毛翼管鼻蝠(Harpiocephalusharpia)序列為外群。

附錄2 圖3a COⅠ序列管鼻蝠GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

本次云南西雙版納熱帶植物園勐臘片區(qū)調(diào)查獲得的管鼻蝠標(biāo)本，經(jīng)外形和分子鑒定后確定分別為菲氏管鼻蝠、哈氏管鼻蝠和艾氏管鼻蝠，其中前2種為云南省蝙蝠新記錄物種。

2.1 3種管鼻蝠外形及頭骨特征描述

2.1.1 菲氏管鼻蝠——云南省蝙蝠新記錄

小型管鼻蝠，前臂長為27.54—31.79 mm，平均為(30.35±1.90)mm(n=6)，鼻部呈短管狀向前延伸；耳廓稍平鈍無缺刻，內(nèi)部有點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)突起；耳屏尖長，約為耳長之半(圖1A)。背部呈灰黑色，背毛基部黑色、中部灰色、毛尖灰褐色；腹部整體呈灰白色，胸部及其兩側(cè)毛發(fā)呈淺褐色調(diào)，毛基深灰色，毛尖銀白色，胸毛毛尖白灰淺褐色(圖1B)。

頭骨小，顱全長為15.56—16.14 mm，平均為(15.80±0.20)mm(n=6)，頭顱稍膨大，吻突不膨脹，吻側(cè)相對狹窄，頭顱中部比前部稍高，眶部有一明顯凹陷，矢狀嵴和人字嵴不顯著，顴弓相對發(fā)達(dá)。齒式為2.1.2.3/3.1.2.3=34。上頜內(nèi)門齒(I2)和外門齒(I3)緊密連接且等高；上犬齒(C)略高或等高于第2上前臼齒(P4)，但上犬齒的基部面積小于P4基部面積；第1上前臼齒(P2)矮小，其高度和基部面積約為P4的1/2；3枚上臼齒(M1、M2和M3)均具明顯而小的中附尖。下犬齒略高于第2下前臼齒(P4)，其基部面積等于或大于P4；第1下前臼齒P2高度約為P4的2/3，其基部面積不到P4的1/2；下臼齒均具有小且明顯的下內(nèi)尖(圖1C)。

2.1.2 哈氏管鼻蝠——云南省蝙蝠新記錄

中等體型管鼻蝠，2只，前臂長分別為35.68、36.99 mm，管狀鼻孔有缺口，朝外且發(fā)達(dá)；耳廓中等大小，較狹長；耳屏垂直呈披針形，長度約為耳廓的一半，上端尖長(圖1D)。背部和額部的顏色相近，覆蓋大量黃褐色毛發(fā)，毛發(fā)尖端到基部顏色由深到淺，毛尖為黃褐色，毛基為淺黃褐色；腹部為淺褐黃色；腹部毛發(fā)毛尖為淺黃褐色，毛基為灰黑色，毛尖與毛基之間顏色漸變，無明顯分界線(圖1E)。

頭骨中等大小，顱全長18.71 mm，頭骨外形較平坦，吻突相對較厚，吻突到腦顱均勻升高，具發(fā)達(dá)的矢狀嵴、人字嵴和顴弓，顴弓中部有一隆起。齒式為2.1.2.3/3.1.2.3=34。上犬齒(C)的高度約為第1上前臼齒(P2)的2倍，P2的高度基本與第2上前臼齒(P4)相等；第1上臼齒(M1)和第2上臼齒(M2)具發(fā)達(dá)的中附尖。下犬齒發(fā)達(dá)，下臼齒均具發(fā)達(dá)的下后尖；下頜冠狀突較發(fā)達(dá)(圖1F)。

2.1.3 艾氏管鼻蝠

小型管鼻蝠，前臂長為27.75—28.38 mm，平均為(28.11±0.27)mm(n=7)，管狀鼻孔前突朝向身體左右兩側(cè)；耳廓尖鈍圓；耳屏高度約為耳長的一半，銳尖挺直(圖1G)。背部整體呈棕色，毛基灰黑色，毛中到毛尖從灰黃色逐漸加深到橙棕色，部分毛尖金黃色且有金屬光澤，零散分布在背部、頸背及兩側(cè)和頭部；腹部整體呈灰白色，毛基黑色，毛尖灰白色，上胸部和腹部兩側(cè)淺橘棕色(圖1H)。

頭骨較小，顱全長為13.97—14.96 mm，平均為(14.63±0.35)mm(n=7)，腦顱前部及中部膨大，眶部有一明顯凹陷，矢狀嵴缺失，人字嵴不發(fā)達(dá)；顴弓纖細(xì)，不發(fā)達(dá)。齒式為2.1.2.3/3.1.2.3=34。上犬齒(C)高于第2上前臼齒(P4)，其基部面積小于P4；第1上前臼齒(P2)矮小，遠(yuǎn)低于P4，前者基部面積不到后者的1/2；上臼齒(M1和M2)具發(fā)達(dá)中附尖。下犬齒高于第2下前臼齒(P4)，其基部面積等于或稍大于P4；第1下前臼齒P2較小，其齒冠面積約為P4的1/2，高度約為P4的2/3(圖1I)。

2.2 3種管鼻蝠頭骨指標(biāo)的數(shù)值分類

對國內(nèi)外及本研究合計(jì)107份標(biāo)本的10項(xiàng)頭骨指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前兩個(gè)主成分占總體信息的93%，其中主成分1(PC1)為77%，主成分2(PC2)為16%(圖2A)。PC1與除眶間寬(IOW)外測量指標(biāo)存在較高的正相關(guān)，集中反映出頭骨數(shù)據(jù)的整體大小效應(yīng)，將哈氏管鼻蝠從三者中區(qū)分開；PC2則與頭骨數(shù)據(jù)中的眶間寬相關(guān)(表3)。但對于同屬于“suilla-type”的艾氏管鼻蝠和菲氏管鼻蝠[25]，主成分分析散點(diǎn)圖無法將兩者明顯區(qū)分開(圖2A)。主成分判別分析(DAPC)的結(jié)果與PCA類似，前兩個(gè)判別函數(shù)可解釋總體變異的96.3%。其中顴寬和下頜長對判別值1(DF1，量符號為DF1)具較高的貢獻(xiàn)度，顱全長和下頜長對于判別值2(DF2)有大的貢獻(xiàn)度(表3)。在DAPC中艾氏管鼻蝠與菲氏管鼻蝠雖無法明顯區(qū)分，但前者主要集中在左側(cè)(DF1<-3)而后者主要集中在右側(cè)(-5

表3 基于頭骨度量數(shù)據(jù)的主成分(PCs)中的變量載荷和判別函數(shù)(DFs)中原始變量的貢獻(xiàn)度

2.3 3種管鼻蝠系統(tǒng)發(fā)育

基于COⅠ序列構(gòu)建的ML和貝葉斯樹均顯示，GZHU 19168、19206、19210、19236、19311、19313、19314與NCBI-nt中艾氏管鼻蝠聚為高支持度的一支(自展值100，后驗(yàn)概率1.0；圖3A)；GZHU 19216、19230與NCBI-nt中哈氏管鼻蝠聚為一支(自展值100，后驗(yàn)概率1.0；圖3A)；GZHU 19167、19180、19181、19318、19320、19335與NCBI-nt中菲氏管鼻蝠聚為一支(自展值100，后驗(yàn)概率1.0；圖3A)。基于Rag2序列構(gòu)建的ML和貝葉斯樹與基于COⅠ序列支系結(jié)果一致(圖3B)。

2.4 云南管鼻蝠的物種多樣性

隨著云南省翼手類調(diào)查和研究的逐步深化，蝙蝠科管鼻蝠屬物種豐富度逐漸顯現(xiàn)。云南省原有金管鼻蝠(M.aurata)[26]、白腹管鼻蝠(M.leucogaster)[6]、羅蕾萊管鼻蝠(M.lorelieae)[27]3種記錄，近期西雙版納還報(bào)道了艾氏管鼻蝠、圓耳管鼻蝠2種云南新分布[7-8]，現(xiàn)又新增本研究哈氏管鼻蝠、菲氏管鼻蝠2種管鼻蝠新發(fā)現(xiàn)，故云南省現(xiàn)有管鼻蝠7種，其中西雙版納分布有圓耳管鼻蝠、艾氏管鼻蝠、哈氏管鼻蝠和菲氏管鼻蝠4種，說明該地區(qū)的管鼻蝠物種資源豐富。

上述7種管鼻蝠中，由《中國脊椎動(dòng)物紅色名錄》[28]列為近危(NT)等級的有金管鼻蝠等3種(表4)，列為無危(LC)等級的有1種，列為數(shù)據(jù)缺乏(DD)等級的2種，菲氏管鼻蝠尚未列入。而根據(jù)IUCN(2020年)名錄，列為無危(LC)等級的有白腹管鼻蝠等4種，列為數(shù)據(jù)缺乏(DD)等級的有2種，艾氏管鼻蝠尚未列入。

表4 云南管鼻蝠的標(biāo)本采集及瀕危情況

3 討論

菲氏管鼻蝠在18世紀(jì)后葉被命名[29]，隨后在越南、老撾、中國等地區(qū)有分布報(bào)道[25，30]，至今該種在國內(nèi)分布于廣西、貴州、廣東和江西[22，30]。哈氏管鼻蝠為Csorba等[31]于2005年依據(jù)柬埔寨標(biāo)本命名的新種，隨后在緬甸、泰國、越南和柬埔寨均報(bào)道有分布[1]，國內(nèi)分布包括海南、廣東和江西[23，32-33]。艾氏管鼻蝠是Furey等[34]在越南北干省發(fā)現(xiàn)并命名的新種，其特征與金管鼻蝠極為相似，容易混淆。隨后的資源調(diào)查提示其分布較廣，在老撾、越南及中國的廣西、貴州、湖南、廣東、海南和云南均有分布[2-8，35-38]。本研究報(bào)道的上述3種管鼻蝠外部形態(tài)和頭骨形態(tài)指標(biāo)都與前人的研究基本吻合(表1和表2)。

根據(jù)上頜骨牙齒的相對大小和形狀可將管鼻蝠類群分成suilla-type和cyclotis-type 2類：suilla-type種類上犬齒齒冠面積小于第2上前臼齒齒冠面積，反之則屬于cyclotis-type[25]。云南分布的金管鼻蝠、白腹管鼻蝠、羅蕾萊管鼻蝠、菲氏管鼻蝠和艾氏管鼻蝠5種屬于suilla-type，圓耳管鼻蝠和哈氏管鼻蝠屬于cyclotis-type。在suilla-type組中，金管鼻蝠、艾氏管鼻蝠和菲氏管鼻蝠的形態(tài)相似，體型較小，而白腹管鼻蝠和羅蕾萊管鼻蝠的體型較大，可進(jìn)一步予以區(qū)分。金管鼻蝠和艾氏管鼻蝠的背部顏色相近，整體呈棕色，背部毛尖為黃棕色，艾氏管鼻蝠上犬齒高于P4，且上臼齒(M1和M2)的中附尖發(fā)達(dá)明顯，金管鼻蝠上犬齒和P4幾乎等高，上臼齒(M1和M2)的中附尖不明顯；菲氏管鼻蝠背部顏色較為深暗，為灰黑色，同時(shí)其外形指標(biāo)及頭骨指標(biāo)都大于艾氏管鼻蝠。體型較大的白腹管鼻蝠和羅蕾萊管鼻蝠2種背部均呈紅棕色，白腹管鼻蝠無矢狀嵴，P2的高度約為P4的2/3，羅蕾萊管鼻蝠具矢狀嵴和人字嵴，P2的高度小于P4的1/2[27]。在cyclotis-type組中，哈氏管鼻蝠體型明顯較圓耳管鼻蝠大，且具有發(fā)達(dá)的矢狀嵴和人字嵴，P2和P4基本等高，圓耳管鼻蝠的矢狀嵴和人字嵴不發(fā)達(dá)，P2約為P4的2/3高[1，39]。基于上述形態(tài)學(xué)特征可將現(xiàn)階段云南發(fā)現(xiàn)的各種管鼻蝠予以鑒別分辨。

根據(jù)本次研究采用線粒體COⅠ基因和核基因Rag2構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果(圖3)，也支持由形態(tài)特征進(jìn)行鑒定的分類結(jié)果。在本次構(gòu)建的發(fā)育樹中也顯示出如Kuo等[40]所描述的艾氏管鼻蝠和姬管鼻蝠(M.gracilis)、隱姬管鼻蝠(M.recondita)之間較近的親緣關(guān)系，以及Ruedi等[41]所描述東南亞地區(qū)的菲氏管鼻蝠和M.jaintiana存在密切的親緣關(guān)系。線粒體基因COⅠ和核基因Rag2的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菲氏管鼻蝠均存在2個(gè)遺傳差異比較大的支系，值得后續(xù)進(jìn)一步開展親緣地理學(xué)分析。

云南位于我國西南邊陲，終年溫暖潮濕，屬典型的熱帶或亞熱帶季風(fēng)氣候，覆蓋有大面積的熱帶林或亞熱帶季風(fēng)林，植被類型多樣，生物資源豐富。該區(qū)域與越南、老撾和緬甸三國接壤，氣候環(huán)境及森林植被相似。近年隨著對森林型蝙蝠多樣性資源調(diào)查增多，調(diào)查工具不斷更新，包括分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，因此短時(shí)間內(nèi)在云南勐臘集中發(fā)現(xiàn)了4種管鼻蝠新記錄，揭示了云南翼手目物種資源具有豐富的多樣性。周邊國家分布的M.jaintiana、M.annamitia、M.fionae等管鼻蝠也可能在云南被發(fā)現(xiàn)[1]，提示有進(jìn)一步加大調(diào)查力度的必要。