用Biolog-ECO板分析動物籠舍環境微生物

王興金 薩家祺 李冠惠 黎繪宏 成世清

(廣州動物園，廣州市野生動物研究中心，廣州，510070)

動物的生活環境，包括微生物環境，與動物健康的關系非常密切，不僅因為致病微生物危害動物健康，環境微生物群落還可能通過影響動物腸道菌群而對動物健康產生間接影響。研究表明，圈養和野生大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)腸道微生物群落存在一定差異，與其棲息環境、食物資源、活動節律等的影響密切相關[1]。為探討動物籠舍環境微生物，分別從廣州動物園靈長類(Primates)、爬行類(Reptilia)動物籠舍收集了15個環境樣本，并采用Biolog-Eco方法進行分析，以期了解動物園動物籠舍環境微生物活性及其影響因素，為更好地養護野生動物提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及處理

樣本采集和處理：在動物籠舍的四周及中央部位無菌采集5處墊材樣本，共約10 g，按m(樣本)∶V(滅菌蒸餾水)=1 g∶9 mL的比例處理樣品后，置恒溫振蕩箱中，4℃振蕩1 h，取上清液用滅菌蒸餾水稀釋10倍后接種ECO板，150 μL/孔，37℃培養，每24 h分別讀取OD590和OD750值。樣本來源見表1。

表1 動物籠舍墊材樣本來源

1.2 數據分析

微生物代謝活性用平均顏色變化率(average well color development，AWCD，量符號為DAWC)表示，其計算方法為：

DAWC=∑(C-R)/n

式中：C為每個碳源孔在590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值；R為對照孔的吸光度值；n為培養基碳源種類數。當C-R的數值小于0.06時矯正為0處理[2-3]。

對得到的AWCD數據分別采用SPSS 17.0進行方差分析、vegan v2.5-6進行主成分分析、flashClust v1.01-2進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 各樣本對ECO板碳源的利用情況

AWCD值反映了樣本中微生物的代謝活性，即對碳源的利用能力。15個樣本中微生物利用全部31種碳源的AWCD變化曲線如圖1A所示。大部分樣本在24—48 h的AWCD曲線斜率最大，此前、后曲線斜率均較低，在96—120 h基本穩定。但來自墊材C的S11、S15、S13樣本的AWCD曲線斜率在24 h內最大，此后變化趨于平緩；S1的AWCD絕對值雖然較低，但上升趨勢明顯。

選擇培養96 h的各樣本的AWCD值進行方差分析，結果15個樣品對碳源的利用存在極顯著的差異(P<0.01，表2)；對各樣本的AWCD值進行多重比較(multiple comparisons)，發現S11除與S1沒有顯著差異(P>0.05)外，均極顯著低于其他各樣本(P<0.01)；而S1除了與S3、S9、S11、S13、S15無顯著差異(P>0.05)外，均極顯著低于其他樣本(P<0.01，表3)。從絕對數值看，AWCD值排在最低的5個樣本依次為S11、S1、S15、S3、S13，其中S11、S13、S15均為墊材C，S1、S3為墊材A。

表2 動物籠舍墊材樣本對碳源利用的AWCD的方差分析結果

為了進一步分析各樣本微生物對ECO板中不同類型碳源的利用情況，將ECO板的31種碳源分為6大類[4]，分別計算各樣本利用每類碳源的AWCD值，并進行方差分析(表2)。結果，15個樣本對碳水化合物、氨基酸、胺類等3類碳源的利用存在極顯著差異(P<0.01)，而對羧酸、多聚物、酚酸類等碳源的利用差異不顯著(P>0.05)。

對存在差異的碳水化合物、氨基酸、胺類3類碳源利用的AWCD值進行樣本間多重比較(表3)。結果，在對碳水化合物的利用上，S11除與S1、S9、S15無顯著差異(P>0.05)外，極顯著低于其他各樣本(P<0.01)，S15的AWCD值也極顯著低于S4、S6、S14(P<0.01)；在對氨基酸的利用上，S1極顯著低于S4、S5、S7、S10、S12、S14(P<0.01)，S11極顯著低于S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14(P<0.01)，S13極顯著低于S14(P<0.01)；對胺類的利用上，S1極顯著低于S2、S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14、S15(P<0.01)。整體上，S11、S1、S15、S13對碳源的利用活性較低，除S1外其他3個都是墊材C樣本。

表3 動物籠舍墊材樣本對碳源利用的AWCD的post hoc檢驗結果(僅顯示P<0.05)

存在樣本間差異的碳水化合物、氨基酸、胺類3類碳源的AWCD隨培養時間的變化曲線顯示：對碳水化合物的利用，來自墊材C的S11、S13、S15樣本在24 h內曲線斜率最大，此后較明顯地變平緩或下降，而其他樣本在48 h前的曲線斜率均較大(圖1B)；對氨基酸的利用，S11、S13、S15樣本的曲線斜率在24 h內最大，而其他樣本的曲線斜率最大值出現在24—48 h，且曲線向上的趨勢持續時間更長(圖1C)；對胺類的利用，S11和S15的曲線斜率在24 h達到最大值，S13則在24—48 h達到最大值，但隨后的曲線斜率均下降較快，而其他樣本的曲線向上的持續時間更長，S1的絕對值雖然較低，卻呈現持續向上的趨勢(圖1D)。

將培養72、96、120 h AWCD較高的前6個樣本從高到低進行排序(表4)。結果可見，在對全部31種碳源利用活性較高的樣本中均出現了S4、S5、S7、S10、S14樣本，此外S2、S12各出現1次。其中，除S7為墊材B外，其余樣本均來自墊材A，而墊材C樣本沒有出現在其中。將碳源分為6大類后，在前述培養時間段，僅對酚酸類的利用中出現了1個墊材C樣本，對其余5類碳源的利用中均未出現墊材C樣本(即S11、S13、S15)。此外，S1和S3也未出現在表4中。

表4 不同培養時間動物籠舍墊材對碳源利用活性排名前6的樣本

2.2 相同環境樣本AWCD的差異性

在所有15個樣本中，4個來自黑猩猩的環境樣本(S6、S7、S8、S9)各種條件最為一致，即動物種類相同、日常管理相同、墊材類型相同。4個樣本培養96 h后的AWCD僅對碳水化合物的利用上存在顯著差異(P<0.05)，即S6對碳水化合物的利用活性顯著高于S9(P<0.05)，其他樣本對各類碳源的利用均差異不顯著(P>0.05，表5)。提示，在動物種類、墊材類型、日常管理方法等條件相似的情況下，環境微生物活性也比較相似。

表5 黑猩猩籠舍墊材樣本(S6、S7、S8、S9)AWCD的方差分析結果

2.3 主成分與聚類分析

為進一步探究各樣本微生物對碳源利用的相互關系，對培養96 h后的各樣本的AWCD進行了主成分分析(圖2)和聚類分析(圖3)。其中，圖2顯示S1與其他樣本存在比較明顯的分異現象，其他樣本間沒有明顯的規律可循，即動物種類之間或籠舍墊材之間沒有明顯的相關性，聚類分析也得到類似的結果。

3 討論

Biolog方法是通過微生物對多種碳底物的不同利用類型來反映微生物群落的功能多樣性[5]，可以直接反映微生物群落的總體活性，在表征細菌群落動態變化的時空尺度上有顯著的優勢[6-7]，且具有數據量大、方便、快捷等優點，近年來被廣泛應用于土壤、水體和環境等領域[8-9]。其中，生態板(ecology plate，ECO板)在土壤微生物群落功能多樣性研究中應用更為廣泛[4]，也用于動物的腸道微生物研究[10]，但在野生動物籠舍環境微生物的研究方面未見報道。

本研究收集的樣本分別來自5種靈長動物和3種爬行動物籠舍的3種不同類型的墊材，采用Biolog-ECO板對樣本的微生物活性進行分析。結果表明，15個樣本的微生物活性存在極顯著差異(P<0.01)。為進一步分析各樣本中微生物對ECO板中不同類型碳源的利用情況，將ECO板的31種碳源分為6大類。結果，15個樣本中微生物群落的差異主要表現為對碳水化合物、氨基酸、胺類3類碳源的利用上(P<0.01)，對羧酸、多聚物、酚酸類的利用差異不顯著(P>0.05)，提示這些動物籠舍的環境微生物群落存在某種相似性。

將動物種類、墊材類型、日常管理均一致的來自黑猩猩籠舍的4個樣本(即S6、S7、S8、S9)單獨進行分析。培養96 h后的AWCD僅S6對碳水化合物的利用顯著高于S9(P<0.05)，其他樣本對全部31種碳源的利用，或將碳源分為6大類后進行比較，均差異不顯著(P>0.05)。提示同種動物、籠舍環境相似、日常管理相同，環境微生物活性也比較一致。

將培養72、96、120 h的AWCD進行排序。發現，AWCD較高的樣本主要來自墊材A，其次為墊料B，而AWCD較低的樣本則主要來自墊材C。此外，來自墊材A的S1和S3的AWCD也較低。考慮到S1和S3取樣時距離籠舍消毒的時間較近，推測消毒是影響環境微生物活性的重要因素，而墊材的類型相比動物種類而言，對環境微生物的影響更大，本研究中微生物活性自高到低的墊材類型依次為墊材A、墊材B、墊材C。AWCD隨培養時間的變化曲線也說明籠舍內墊材類型與環境微生物活性有關，來自墊材C的樣本的曲線前期斜率最大，隨后迅速變緩甚至下降；而來自墊材A和墊材B的樣本的AWCD曲線向上的持續性則更為明顯。

對全部15個樣本的AWCD進行主成分分析及聚類分析，結果S1與其他樣本存在比較明顯的分異現象，但其他樣本之間似乎沒有明顯的規律可循，提示消毒對S1微生物活性產生了明顯的影響。動物籠舍環境微生物的組成比較復雜，可能的影響因素較多，有待進一步研究。如，奶牛舍沙土墊料的鋪墊時間、環境溫度等對細菌數量都有顯著影響[11]。

致謝：承蒙廣東省微生物研究所李安章副研究員給予指導。