卷羽鵜鶘源大腸埃希菌和糞腸球菌的分離及耐藥性試驗

張佰蓮 馬 珺 劉群秀

(1.上海農林職業技術學院，上海，201699；2.上海動物園，上海，200335)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是動物和人的腸道中常見的條件致病菌[1]，在正常生理狀態下不會引起發疾病，而一旦宿主機體的免疫功能受到抑制，則會引起多種疾病[2-3]，威脅公共衛生安全。近年來，人和動物感染大腸埃希菌和糞腸球菌的病例不斷出現，而抗菌藥物的不合理使用又增強了2個菌種的耐藥性，因此大腸埃希菌和糞腸球菌成為臨床治療的一大難題[4]。卷羽鵜鶘(Pelecanuscrispus)是我國一級重點保護野生動物，被世界自然保護聯盟(IUCN)列為近危物種(NT)[5-6]。由于生境破壞，卷羽鵜鶘的野外種群數量大幅減少，上海動物園現有卷羽鵜鶘種群40余羽。徐正強等[7]報道了人工孵化和育雛的卷羽鵜鶘幼鳥常出現連續發病并死亡的情況，并對幼鳥感染大腸桿菌進行了初步研究。本研究采集上海動物園散放卷羽鵜鶘的糞便樣本，進行大腸埃希菌和糞腸球菌的分離與鑒定，旨在深入探討這2個菌種的耐藥性，從而揭示野生動物源病原菌耐藥傳播規律及特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

VITEK 2 Compact?全自動微生物分析系統及配套GN(革蘭氏陰性)和GP(革蘭氏陽性)細菌鑒定卡、比濁儀，法國生物梅里埃公司；Riboprinter?微生物基因指紋鑒定系統，美國杜邦公司；Sensititre?全自動菌液接種儀，美國賽默飛公司。

1.1.2 主要試劑

普通營養肉湯及營養瓊脂，北京陸橋技術有限責任公司；麥康凱瓊脂、腸球菌顯色營養瓊脂，美國BD公司；腸道桿菌和腸球菌藥敏板測試盒，12 mL MH肉湯管，天津市金章科技發展有限公司；質量濃度0.85%的無菌氯化鈉溶液。

1.1.3 菌株來源

大腸埃希菌和糞腸球菌：2019年8月在上海動物園鵜鶘樣本中分離得到；質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212，美國標準菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 采樣

以滅菌棉簽拭子采集卷羽鵜鶘泄殖腔樣品，置入運送培養基中。共采集9份。

1.2.2 細菌分離與純化

大腸埃希菌：取拭子樣品用接種棒直接接種于麥康凱瓊脂平板，(36±1)℃培養18—24 h，挑取可疑菌落進行純化培養，然后接種于營養瓊脂平板，37℃培養12—24 h。

糞腸球菌：取拭子樣品用接種棒直接接種于腸球菌顯色瓊脂平板，(36±1)℃培養18—24 h，挑取可疑菌落進行純化培養，然后接種于營養瓊脂平板，(36±1)℃培養16—18 h。

1.2.3 細菌鑒定

應用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統，基于GN和GP細菌鑒定卡片對分離得到的菌株進行鑒定。對鑒定出的大腸埃希菌和糞腸球菌采用Riboprinter系統進行驗證鑒定。再將全自動微生物生化法鑒定出的菌株與Riboprinter系統的鑒定結果進行對比，最終確認目標菌株。

1.2.4 藥敏試驗

對分離鑒定出的大腸埃希菌和糞腸球菌分別進行11大類13種抗菌藥物和9大類12種抗菌藥物藥敏試驗，測定結果按CLSI標準(2018版)確定判定臨界值，劃分為敏感(S)、中敏(I)和耐藥(R)。最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值的讀取參照見表1和表2。

表1 大腸埃希菌對13種抗菌藥物藥敏試驗臨界值的判定值和質控范圍

表2 糞腸球菌對12種抗菌藥物藥敏試驗臨界值的判定值和質控范圍

2 結果與分析

2.1 細菌分離與鑒定

對9份糞便樣本進行分離與純化后，采用全自動微生物生化鑒定法與Riboprinter系統鑒定法的鑒定結果一致，分別分離鑒定出大腸埃希菌9株(分離率100%)，糞腸球菌7株(分離率77.8%)。

2.2 藥敏試驗結果

大腸埃希菌(9株)對氨芐西林(AB)、四環素(TE)和磺胺異惡唑(SF)的耐藥性均較強，對阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢噻呋(CEF)、多西環素(DO)、氟苯尼考(FFC)、氧氟沙星(OFL)和多黏菌素E(PME)均較為敏感(表3)；糞腸球菌(7株)對青霉素(PG)、紅霉素(EM)、四環素(TE)的耐藥性均較強，對鏈霉素(SM)、呋喃妥因(NF)、氯霉素(CM)和萬古霉素(VM)均較為敏感(表4)。

表3 卷羽鵜鶘源大腸埃希菌對13種抗菌藥物的藥敏試驗結果

表4 卷羽鵜鶘源糞腸球菌(7株)對12種抗菌藥物的藥敏試驗結果

3 討論

細菌耐藥性的出現和耐藥細菌的感染常使經驗性治療難以奏效，給獸醫臨床抗感染治療帶來極大的挑戰，對動物的健康造成嚴重威脅。大腸埃希菌和糞腸球菌分別是表示抗菌藥物耐藥性水平的一種革蘭氏陰性和陽性指示菌，其耐藥譜是腸道菌群耐藥基因水平傳播評估的重要指標[8]。因此，十分有必要對卷羽鵜鶘分離的細菌和糞腸球菌的耐藥性情況進行分析和研究。本研究選取上海動物園天鵝湖散放的卷羽鵜鶘源大腸埃希菌和糞球桿菌開展研究，根據指示菌的抗菌藥物耐藥水平，可進一步為獸醫臨床用藥提供參考和基礎數據。

研究表明，大腸埃希菌和糞球桿菌是腸道微生物群落中的重要菌屬，通過基因重組，可以獲得大量耐藥基因和毒力基因，能夠在人和動物的種群水平廣泛傳播[9-10]。通常情況下，抗生素的使用會對腸道菌群產生選擇壓力，增加腸球菌成為優勢菌種的可能性[11]，即抗生素的不合理使用，加劇了大腸埃希菌和糞腸球菌的耐藥性，加之其復雜的致病機制，使得這2個菌種發生感染的臨床治療更加困難。在上海動物園內，卷羽鵜鶘在天鵝湖島嶼上成群棲息，增加了細菌傳播風險，應在日常管理中加強島嶼的清潔與衛生。

本研究中，大腸埃希菌對氨芐西林(AB)、四環素(TE)和磺胺異惡唑的耐藥性較強，糞腸球菌(7株)對青霉素、紅霉素、四環素的耐藥性均較強。四環素作為臨床上常用的抗生素，長期大量的使用造成了很多家畜體內細菌四環素耐藥水平的增高[4]。如延邊地區豬(Susscrofascrofa)源大腸埃希菌四環素耐藥率為89%[12]，吉林地區豬源大腸埃希菌四環素耐藥率為83.63%[13]，豬源糞腸球菌耐四環素的菌株比例也非常高[14-16]。本研究中，大腸埃希菌和糞腸球菌對四環素的耐藥率均為100%，需要給予足夠的重視。糞腸球菌的耐藥性主要分為染色體介導的天然性耐藥和染色體外遺傳物質所誘導的獲得性耐藥，該菌的天然耐藥性比臨床上許多其他革蘭氏陽性菌都要強[4]。本研究的部分結果與以往的研究相似，如大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥率高達70%[17-18]，糞腸球菌對青霉素的耐藥率大于70.0%[19]。鑒于以上研究，建議經常開展菌種的耐藥性檢測，并依據藥敏結果選擇合適的抗生素，還應考慮抗生素種類及用量的合理選擇，以更好地發揮作用。

致謝：本研究開展過程中得到上海動物園飼養科和獸醫院的大力支持，在此一并表示感謝。