低溫脅迫下北方林蛙冷凍保護劑系統研究進展

李玉瑩 金莉莉 王秋雨

(遼寧大學生命科學院，沈陽，110036)

林蛙屬(Rana)物種是一類具有鼓膜和背側褶皺，腳趾有蹼，顳面黑色，非繁殖期在山林生活的棕色蛙類，在歐洲，林蛙因為其棕褐色的皮膚，也被叫作棕蛙(brown frog)[1-3]，是最廣為人知的兩棲動物之一。林蛙俗稱哈什蟆，隸屬兩棲綱(Amphibia)，無尾目(Anura)，蛙科(Ranidae)，林蛙屬[1]。1785年，林奈將歐洲蛙定名為Ranatemporaria，時至今日林蛙在全球命名已有40余種，我國有17個林蛙的獨立有效物種[2，4]。林蛙不僅在中國分布廣泛，在俄羅斯遠東、蒙古東部、朝鮮半島、日本北海道等地區均有分布[2]。其中，分布于北方的林蛙具有冬眠期。9月以后天氣轉涼，溫度降到10℃以下時，東北林蛙(R.dybowskii)陸續回到水下或者藏身在地下，進入冬眠期[5]。Voituron等[6]也發現相似的行為現象，觀察到在0℃以下的初冬，田野林蛙(R.arvalis)從池塘中出來并在上部土壤和枯枝落葉層中冬眠。這些林蛙具有耐凍性，為自身在零下溫度環境下的存活提供了保障。耐凍性是指在低溫條件下的生物能夠忍受細胞外和器官外空間結冰而不死亡的性質[7-8]。生活在亞北極地區的林蛙如R.sylvatica能夠在低至-16℃的溫度，65%的身體水凍結的環境條件下存活[9]。除此之外，對林蛙屬的其他物種如黑龍江林蛙(R.amure-nsis)、豹蛙(R.pipiens)和歐洲綠蛙(R.ridibunda)等的耐凍性也均有報道[10-12]。筆者綜述了分布于北方的林蛙在低溫脅迫下冷凍保護系統的研究進展，旨在為從事相關研究的科學工作者提供參考。

1 北方林蛙的冷凍保護系統

隨著對林蛙耐凍性的不斷深入研究，學者們發現林蛙體內存在一套冷凍保護劑系統，使其在冬季的冷凍中存活，葡萄糖和尿素是2種主要的冷凍保護劑[13]。二者都可以通過積極的作用來限制體內冰的形成，且兩者都可以提供特殊的作用，包括調節代謝和抗氧化等，以保護生物膜和大分子免受離子滲透擾動[14]。

1.1 冷凍保護劑——葡萄糖

1.1.1 糖原的儲存與來源

葡萄糖在低溫下對林蛙有保護作用，升高的葡萄糖水平可以降低林蛙體內冰的含量和體內紅細胞的損傷，組織中葡萄糖水平是決定林蛙冷凍耐受能力的關鍵因素[15]。糖原是一種重要的冬季能量儲備方式，也是耐寒林蛙冷凍保護劑葡萄糖的主要來源。林蛙體內的糖原在夏末和秋季積累，在冬季和春季消耗[16]。因此，肝臟中的糖原含量在冬季開始時最高，春季產卵后最小，林蛙的糖原貯存庫呈現出明顯的季節性模式[17]。

某些蛙類冬眠前脂肪體的脂解作用會增加，用來支持糖原的生成。在秋季糖原儲備階段，牛蛙(R.catesbeiana)的脂質存儲降低，脂質代謝使血糖被分流到糖原中[18]。Costanzo等[9]的研究也發現，林蛙在糖原沉積期間大大消耗了它們的脂肪。脂肪氧化代謝是耗氧過程，而林蛙冬眠期間處于缺氧狀態[19]，所以脂肪不能在缺氧的冷凍組織中被氧化。然而在冬眠準備期，林蛙將體內脂肪分解代謝，產生大量的糖異生前體(如甘油三酸酯的甘油部分)，這有助于建立肝糖原貯備庫，對林蛙安全度過冬眠期具有重要意義[14]。

林蛙體內的糖原儲存，還依賴蛋白質的分解代謝。在冬季適應過程中林蛙腓腸肌尺寸減小27%，蛋白質的凈流失加速導致肌肉萎縮[9]。大鼠腓腸肌萎縮實驗證實，肌肉萎縮由一組名為“atrogenes”的基因誘導調控，在全身消瘦狀態(禁食，癌癥惡病質，腎衰竭，糖尿病)期間，atrogenes基因的表達在肌肉中被協同誘導或抑制，其中泛素連接酶atrogin-1、MuRF1和萎縮誘導轉錄因子FoxO1對于產生和維持“萎縮”狀態至關重要[20]。冬季林蛙血漿內的游離氨基酸比夏末時期多130%—150%，而蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸等多種糖原性氨基酸的增加，可能會增加冬眠前糖原的合成，甚至可能維持冬眠期間主要的代謝，因此Costanzo等[13]認為蛋白質分解代謝對林蛙冬眠的準備起著重要和尚未被清晰認知的作用。

1.1.2 葡萄糖動員

冬眠的林蛙能夠應對冷凍而產生強烈的葡萄糖反應。-2.5℃下冷凍48 h的林蛙R.sylvatica體內葡萄糖的質量摩爾濃度比未冷凍的高54—80倍，且葡萄糖水平因器官而異，在肝臟中最高，在骨骼肌中最低，然而這些葡萄糖僅僅是糖原儲存的39%[9]。林蛙遇到更低的溫度，或是溫度升高和降低的循環時，葡萄糖反應更為劇烈。實驗條件下直接冷凍至-8或-16℃時，林蛙的糖原質量摩爾濃度降低了2/3，循環冷凍/解凍處理的林蛙糖原質量摩爾濃度降低近95%[13]。

林蛙在冬季可以忍受長時間的全身冷凍，得益于廣泛的糖原水解和高輸出的葡萄糖質量摩爾濃度在血液和所有組織中的分布。遭遇低溫后，林蛙體內迅速進行葡萄糖動員：①通過活化體內肝臟糖原磷酸化酶(GP)，并抑制糖酵解過程的關鍵酶6-磷酸果糖激酶(PFK)，從而保證了所需的高度糖原分解速率[21]；②林蛙通過增加GP活性和蛋白激酶A(PKA)活性，增強了葡萄糖動員期的糖原分解作用[22]；③林蛙凍結時可激活糖原合成酶激酶3(GSK-3)，并將其下游底物磷酸化，阻止糖原合成。GSK-3的動力學特性對溫度變化結果顯示，冷凍林蛙中的GSK-3比未凍結的林蛙更容易將下游目標磷酸化[23]。冷凍保護劑葡萄糖動員完成后，林蛙通過降低GP的活性來調節其糖原分解反應，從而保留了肝糖原儲備[22]。

葡萄糖冷凍保護劑系統的功效不僅取決于糖原分解的速率，還取決于肝細胞輸出游離葡萄糖的速度。葡萄糖轉運蛋白是一種特殊的載體蛋白，在葡萄糖跨細胞膜的轉運中發揮作用。在所有脊椎動物中，葡萄糖轉運蛋白對葡萄糖穩態的維持起著重要作用，特別是在生理應激時期。比如，低氧時葡萄糖轉運蛋白的變化有利于葡萄糖的利用，葡萄糖作為代謝能量的來源，保護細胞免受缺氧損傷[24]。Rosendale等[25]發現在冷凍條件下，林蛙肝臟葡萄糖轉運蛋白2(GLUT2)的蛋白豐度和mRNA表達增加，說明GLUT2在林蛙冷凍存活中起著重要作用。

1.2 冷凍保護劑——尿素

尿素轉運蛋白(UTs)存在于哺乳動物、魚類、爬行動物和兩棲動物等生物體中。哺乳動物體內UTs參與了多種生理過程，如：腎臟的尿液濃度調節、腸道中的氮循環回收[28]。目前，UTs在耐寒林蛙越冬中的生理作用知之甚少。Rosendale等[25]的研究發現林蛙體內UTs數量隨季節變化，免疫印跡技術表明秋季和冬季的UTs豐度較低，春季則較高。體內UTs的升高可能是由精氨酸血管收縮素(AVT)水平升高引起[29]。

冷凍過程中肝臟中尿素的產生對于林蛙冬季成功存活至關重要。氨基甲酸酯磷酸合成酶1(CPS1)是尿素合成的限速酶。CPS1的動力學參數表明，林蛙冷凍期間肝臟中的CPS1被翻譯后修飾，以增加CPS1活性[30]。Hawkins等[31]對林蛙的磷酸化蛋白質組學分析表明，CPS1、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶1(ARG1)3種尿素循環酶在冷凍、缺氧或脫水暴露時被差異磷酸化。這3種尿素循環酶受到應激反應發生可逆翻譯后調控。谷氨酸脫氫酶(GDH)是尿素生成的一種關鍵酶，GDH分解谷氨酸和NAD+生成馬-酮戊二酸(a-KG)、NADH和銨，可代謝形成尿素。冷凍的林蛙GDH受到翻譯后修飾的調節，以滿足尿素生成的需要[32]。

2 總結與展望

2.1 總結

分布于北方的林蛙在長期的低溫環境下，進化出一系列生理生化機制來應對低溫帶來的損傷，其中研究最為廣泛的是林蛙體內的冷凍保護系統，由尿素和葡萄糖組成。二者都可以限制冰的形成，且兩者都可以提供特殊的作用，包括調節代謝和抗氧化，以保護生物膜和大分子免受離子滲透擾動[14]。在秋季，林蛙體內糖原含量增加，脂質代謝和蛋白質分解以便糖原貯存。當林蛙遭遇低溫時，通過促進糖酵解并抑制糖異生，在體內迅速產生大量的冷凍保護劑——葡萄糖。葡萄糖動員完成后抑制糖原合成，以保證體內足夠的葡萄糖水平(圖1)。

2005年，Costanzo等[26]首次發現尿素在林蛙的耐凍性中起著重要的作用。除了能夠限制冰的形成，還能防止葡萄糖無法阻止的凍融損傷發生[26-27]。低溫條件下，尿素轉運蛋白及尿素生成的相關酶受到調節，以滿足林蛙冬季生存需要(圖2)。

2.2 展望

林蛙在冬季經歷多種生理應激，如冷凍、脫水和低氧等，實驗證實低氧可能是造成冷凍引起的GLUT2豐度變化的原因之一[25]。但是葡萄糖動員期間糖酵解和糖異生相關酶等的調節具體響應什么生理應激而變化，還需要繼續探究。尿素調節相關的多種酶受到翻譯后修飾，如：CPS1、ARG1和ASL。但是這種翻譯后修飾在控制冰凍，缺氧或脫水暴露而在肝臟中起到的作用尚不清楚，還需要繼續探究[31]。

近些年，microRNA成為國內外科學家們的研究熱點，有研究發現林蛙microRNA組織特異性表達：解凍過程中心臟中的21種microRNA表達減少，這些microRNA的減少有利于心臟功能的快速恢復；冷凍的骨骼肌有16種microRNA表達增加，這些microRNA增加有利于抑制代謝節省能量，差異表達的microRNA在林蛙冷凍存活中起著重要作用[33]。然而對耐寒林蛙葡萄糖動員、尿素積累和動員過程相關的microRNA調控機制還未見報道。對耐寒蛙冷凍期間microRNA的相關研究，將有助于了解林蛙冷凍期間發生在轉錄水平的調控。

自然環境下冬眠的林蛙經常因為氣溫變化導致自身經歷連續冷凍和解凍過程，從而積累更多的葡萄糖[34]，且解凍后仍保持高血糖質量摩爾濃度[9]。有研究表明，耐凍林蛙的胰島素結構與其他不耐凍的蛙類不同，美國牛蛙不耐凍，歐洲綠蛙具有耐凍性，胰島素分子結構的選擇性改變可能削弱了與胰島素受體的結合，并導致葡萄糖濃度的異常升高[35]。這些現象與二型糖尿病的發病機制和生理特點契合[36]，所以對冬眠林蛙在高濃度葡萄糖水平條件下生存的機制研究，或許對解決糖尿病問題具有一定的指導意義。

近年來，有學者發現與來自南方地區的林蛙相比，生活在亞北極圈的林蛙具有更強的耐凍性，能夠在更長的低溫時間和更低的溫度下生存[14]。早些年就有學者提出林蛙的種群隨著緯度不同而表現出不同的耐凍性和適應能力[37]。通過對耐凍林蛙越冬生存機理的研究，可以提高人們對林蛙地理分布和演化過程的理解?，F代分子生物學技術的快速發展為研究林蛙越冬的生理生化機制提供了有利條件，利用高通量測序技術分析南北地區林蛙基因序列的差異性，可以更好地理解林蛙的地理分布和演化過程。