基于親水作用色譜-串聯質譜的非衍生化法測定綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物殘留

邱世婷 侯 雪 韓 梅 李 瑩 賀光云 覃蜀迪 沈 璐

（四川省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（成都），成都 610066）

在茶園管理中，除草是一項貫穿整個生產過程的農事活動，草甘膦（glyphosate，GLY）和草銨膦（glufosinate，GLU）是我國登記允許在茶園使用的除草劑[1]，但近年來，濫用草甘膦等引發的茶葉質量安全事故引起消費者越來越多的關注。草甘膦具有與有機磷化合物相似的作用毒理，主要通過抑制膽堿脂酶的活性而導致神經系統機能失調[2]。草銨膦的主要代謝產物為3－（甲基膦基）丙酸（3－methylphosphinico propionic acid，MPP）和N－乙酰草銨膦（N－acetyl glufosinate sodium，NAG）。草銨膦對人體的生殖系統會產生毒性，其代謝產物也具有相似毒性[3]，存在一定風險，因此同時檢測草銨膦及其代謝物十分必要。許多國家和組織已制定草銨膦及其代謝物的最大殘留限量，國際食品法典委員會（CAC）、歐盟、日本和韓國規定草銨膦的殘留定義為草銨膦、MPP和NAG之和[4～6]，我國GB 2763－2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定草銨膦的殘留僅為草銨膦。歐盟、美國、日本和中國對茶葉中草甘膦的最大殘留限量分別為2.0、1.0、1.0和1.0 mg/kg，歐盟、日本和中國對茶葉中草銨膦的最大殘留限量分別為0.1、0.3和0.5 mg/kg。

草甘膦、草銨膦及其代謝物結構類似，含有膦酸基、羥基、氨基，為強極性的兩性化合物，不溶于大部分有機試劑，無發色團或熒光基團，難氣化，在反相液相柱上無保留，采用常規手段對其進行定性定量極困難[8～10]。目前國內外測定綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物通常采用以9－芴基甲基氯仿（9－fluorenylmethyl chlorocarbonate，FMOCCl）為衍生化試劑，通過衍生改善其色譜保留行為，從而可被儀器檢測的方法，但衍生化法操作復雜、耗時長，同時衍生副產物易污染儀器，干擾測定，重現性差[11～13]。近年來，不經衍生直接采用液質聯用測定食品中草甘膦和草銨膦的方法也有報道[14～15]，如YASUSHI等[16]采用InertSep SAX柱凈化，對啤酒、大麥茶中的草甘膦和草銨膦及其代謝物進行了測定；BOTERO－COY等[14]采用HLB柱對大豆、玉米樣品中的草甘膦和氨甲基膦酸進行了測定；孫文閃等[17]采用MWCNTs為凈化劑，對茶葉中草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦進行了測定。但大部分研究集中在草甘膦、草銨膦原藥，少見涉及代謝產物NAG和MPP檢測的報道，也未見采用非衍生化法同時檢測綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物殘留的報道。

基于草甘膦和草銨膦的強極性和陰離子特性，本研究采用親水作用色譜－串聯質譜，結合HLB柱凈化，建立了一種無需衍生，凈化步驟簡單，能同時測定綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物MPP和NAG殘留量的方法，以期為綠茶中的草甘膦、草銨膦及其代謝物的快速測定提供參考。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑LC－30A超高效液相色譜8060三重四極桿質譜儀（日本島津公司）；Multi Reax多管渦旋振蕩器（Heidolph公司）；AUY220電子天平（日本島津公司）；Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機（上海力康儀器有限公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）。

GLY、GLU、MPP、NAG標 準 品（純 度>98%，天津阿爾塔科技有限公司）；PRiME HLB小柱（200 mg/6 mL，美國沃特世公司）；實驗用水為超純水；乙腈、甲酸（色譜純，美國Fisher Scientific公司）。

（二）實驗方法

1.標準溶液的配制。準確稱取10 mg的各農藥標準品，分別用超純水溶解并配制成質量濃度為100 mg/L的單個標準儲備液，于4℃冰箱保存，有效期3個月。分別吸取0.2 mL單個標準儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容至10 mL，配制成質量濃度為2 mg/L的混合標準儲備液，放置于4℃冰箱，有效期1個月。使用時，根據需要用超純水或空白基質配制成適合濃度的上機工作溶液。

2.樣品前處理。稱取粉碎的綠茶樣品1.0 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL超純水提取，渦旋振蕩20 min，8 000 r/min離心5 min，取2 mL通過PRiME HLB小柱，收集流出液，過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜串聯質譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC－MS/MS）測定。

3.液相和質譜條件。（1）液相色譜條件：色譜柱為Waters陰離子極性農藥（anionic polar pesticide）色譜柱（100 mm×2.1 mm，5μm）；柱溫為50℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為10μL；流動相A為0.9%甲酸水溶液，流動相B為0.9%甲酸－乙腈。梯度洗脫程序：0～4 min，0%B～15%B；4～7 min，15%B；7～8 min，15%～90%B；8～12 min，90%B。（2）質譜條件：質譜離子源為電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）源；接口電壓為4 000 V；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；霧化氣流速為3 L/min；干燥氣流速為10 L/min；加熱氣流速為10 L/min；接口溫度為300℃；脫溶劑管溫度為250℃；加熱模塊溫度為400℃。其他質譜參數見表1。

表1 4種化合物的質譜參數

二、結果與分析

（一）質譜條件的優化單獨配制質量濃度為1 mg/L的4種化合物的標準溶液，進行Q1全掃描，經掃描發現，目標化合物在負離子模式下響應強度高、穩定性好，在負離子模式下確定4種化合物的母離子峰均為[M－H]－峰，將其作為母離子，利用儀器自帶自動優化程序，對子離子、碰撞電壓、Q1電壓、Q3電壓進行優化，獲得二級質譜優化參數，最終形成的MRM掃描參數見表1。

（二）色譜條件的優化草甘膦、草銨膦及其2種代謝物在傳統的反相柱中基本無保留，根據其高親水性和強極性特點，本實驗研究選擇親水作用色譜柱進行色譜分離，共評估了4種色譜柱：Asahipak－NH2P－50柱、Dikma polyamino氨基柱、Waters DEA柱、Waters anionic polar pesticide柱。4種色譜柱液相分離條件見表2，0.05 mg/L草甘膦、草銨膦及其代謝物在不同色譜柱上色譜分離圖見圖1?？梢娛褂肁sahipak－NH2P－50柱、Dikma polyamino氨基柱時，4種化合物分離效果差，基本在同一時間出峰，不能達到基線分離，且基質干擾嚴重，靈敏度低。使用Waters DEA柱時，草甘膦色譜峰拖尾。使用Waters anionic polar pesticide柱時，4種化合物分離效果好，峰型尖銳對稱且靈敏度高。Waters anionic polar pesticide柱固定相由具有三鍵鍵合二乙胺（diethylamine，DEA）鍵合相的亞乙基橋雜化（bridge ethylidene hybrid，BEH）顆粒組成。這種鍵合相兼具親水性表面和陰離子交換特性，適合用于保留和分離極性陰離子化合物。4種化合物均有強陰離子膦酸鹽基團，在弱酸性溶液中為強電離狀態帶負電，通過陰離子交換保留在柱上，用0.9%甲酸的酸性流動相洗脫陰離子，4種目標化合物分離效果和峰形均較好，加入鹽（如甲酸銨）后反而對峰分離效率和峰形狀產生了不利影響，并導致分析物的靈敏度降低，故本研究選取Waters anionic polar pesticide柱作為分析色譜柱，含0.9%甲酸的水和乙腈為流動相。

表2 4種色譜柱液相分離條件

（三）前處理條件的優化考慮綠茶基質復雜，含有大量的氨基酸、茶多酚、咖啡因、色素等干擾物質，本研究參照文獻[17］前處理方法比較了50 mg MWCNTs、50 mg GCB作為吸附劑，和本文PRiME HLB小柱方法，得出空白基質凈化后的負離子模式下全掃描圖（見圖2），結果可見HLB小柱凈化基質干擾較少。PRiME HLB小柱填料為親水親脂反相吸附劑，能較好吸附綠茶中茶多酚、咖啡因、氨基酸等雜質[19］。采取過濾式凈化模式，SPE柱無需活化、淋洗和洗脫步驟，綠茶樣品經純水提取后，取上清液直接過小柱，收集洗脫液即可上機測定，4種目標化合物回收率為78.8%～101.5%。該法操作簡單，且能有效去除綠茶中的基質干擾，無需用到有機試劑，綠色環保，因此本研究選擇PRiME HLB小柱作為凈化方式。

圖2 不同前處理方式凈化后質譜全掃描色譜圖

（四）方法分析性能

1.線性關系、檢出限和定量限。采用空白綠茶基質配制一系列標準上機溶液，以目標化合物峰面積（Y）為縱坐標，相應的質量濃度（X，μg/L）為橫坐標計算線性關系，以3倍信噪比（S/N）計算檢出限（limit of detection，LOD），以10倍信噪比（S/N）計算定量限（limit of quantitation，LOQ），結果見表3。在各自的相應范圍內，4種化合物線性關系良好，相關系數均＞0.999，方法檢出限為0.01～0.05 mg/kg；定量限為0.05～0.10 mg/kg，方法靈敏度高。

表3 4種化合物在綠茶中的線性關系、檢出限、定量限及基質效應

2.回收率與精密度。分別在LOQ、2LOQ、10LOQ 3個濃度水平下對空白綠茶進行添加回收實驗，每個濃度水平平行6次。4種化合物的加標回收率和相對標準偏差結果見表4。由表4可見，4種化合物回收率在78.8%～101.5%，相對標準偏差（RSD）為4.3%～11.1%，該方法的回收率和相對標準偏差滿足農藥殘留檢測中對準確度和精密度的要求。草甘膦、草銨膦及其代謝物在綠茶樣品中加標回收（添加量0.2 mg/kg）及綠茶空白樣品圖譜見圖3。

圖3 草甘膦、草銨膦及其代謝物在綠茶樣品中加標回收（添加量0.2 mg/kg）及綠茶空白樣品圖譜

表4 4種化合物的加標回收率和相對標準偏差（n＝6）

3.基質效應。取綠茶空白基質溶液和試劑配制4種化合物的標準溶液，分別測定溶劑中目標農藥的響應值（A）與空白基質中添加相同濃度的目標農藥的響應值（B），基質效應（matrix effect，ME）=（B/A－1）×100%，ME值為負數，說明存在基質抑制效應；ME值為正，說明存在基質增強效應。實驗結果表明，4種化合物在綠茶均存在不同程度基質抑制效應，其中草銨膦為強抑制效應（見表3），因此本研究采用基質匹配標準溶液外標法定量。

4.與其他方法的比較。本研究將本方法與文獻報道[1，18，20～22］的 前處理 方 法在 消 耗時間、 有機 試劑消耗體積、定量限等方面進行了比較（見表5）。可知本方法在時間成本、有機試劑消耗量和定量限等方面有明顯的優勢，且操作簡單，可滿足實際樣品的檢測要求。

5.實際樣品的檢測。應用該方法對四川省市場上的67個綠茶樣品進行了檢測，結果顯示，67批次綠茶中草銨膦及其代謝物均未檢出，但40個樣品檢出草甘膦（>LOD），檢出率超過50%，定量檢出（>LOQ）范圍為0.050 0～0.585 0 mg/kg，均未超過GB 2763－2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中的規定限量值，說明茶園中使用草甘膦情況較為普遍，應當加以管控，避免綠茶中草甘膦殘留對人體造成危害。

三、結 論

本研究建立了PRiME HLB小柱凈化，結合親水作用色譜－串聯質譜同時測定綠茶中草甘膦、草銨膦、3－（甲基膦基）丙酸，N－乙酰草銨膦殘留的方法。本方法前處理簡單，無需衍生，對環境友好，干擾少，重現性好，可作為大批量綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物的分析檢測方法。