植物中吡咯里西啶生物堿的檢測分析方法研究進展

朱 雷 花日茂 王路瑤 焦衛(wèi)婷

（安徽農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，安徽省農產品質量安全重點實驗室，合肥 230036）

吡咯里西啶生物堿 （pyrrolizidine alkaloids，PAs）作為植物的次生代謝產物，是植物界為了保護自身免受捕食者侵害而產生的一類天然毒素，在世界各地不同地理環(huán)境中均有廣泛的分布。PAs主要分布于開花植物中，目前，已在6 000多種開花植物中發(fā)現(xiàn)近660種不同結構的PAs[1]，這類生物堿多衍生自紫草科，菊科的千里光族、澤蘭族，以及豆科的豬屎豆屬，此外在夾竹桃科、蘭科、百合科、玄參科、旋花科、禾本科、唇形科等部分植物中也含有此類生物堿[2]。

PAs是一種復合分子，在結構上一般由次堿（如千里光次堿，necine）和次酸（如千里光次酸，necic acid）2個基本部分組成[3]。千里光次堿的吡咯環(huán)結構為PA的母核，由2個稠合的含氮的五元環(huán)狀結構組成，該部分可被雜酸酯化形成單酯、開鏈雙酯或大環(huán)雙酯[4]。當千里光次堿中N被氧化，可形成相應PANOs，與PAs同時存在于植物體內[5～6]。根據(jù)千里光次堿在1、2位碳原子上形成的鍵型結構的不同，可將PAs分為飽和型PAs和不飽和型PAs兩大類，其中飽和型PAs無明顯毒性，而不飽和型PAs易被細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A氧化，經肝臟代謝形成烯丙醇酯結構的吡咯代謝物。吡咯代謝物易與組織中各種親核性的酶、蛋白質、DNA、RNA結合，引起肝細胞代謝紊亂、脂肪變性和壞死性損傷，對人類和動物有毒害作用[5，7]。

PAs因其毒性已成為國際社會上關注的新熱點，國內外已有眾多學者對PAs的毒性和危害作了深入研究。當人體攝入大量PAs后，會造成急性和慢性肝損害，據(jù)報道，山崗橐吾堿（clivorine，PAs的一種）對肝臟具有直接毒害作用，引起肝臟靜脈閉塞性疾病[8]。YANG等[9]通過比較實驗證實了活性吡咯中間體在誘導肝毒過程中的關鍵作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，PAs攝入過多會引起肺動脈高壓、心臟肥大和腎臟退行性損傷[10]。PAs的吡咯代謝物還能破壞DNA結構或形成DNA交聯(lián)和DNA蛋白復合物，進而誘導基因突變乃至癌變[11]，另外PAs在發(fā)育毒性[12]等方面也有相關報道。KOLREP等[13]和MOREIRA等[14]研究表明，脫氫的PAs和PAs的氮氧化物對人體有直接毒害作用，嚴重時可導致死亡。

PAs和其相應的PANOs威脅人類健康的主要原因是植物源污染，當人體直接攝入含有PAs及其PANOs的植物源食物（野菜、花草茶、中藥材）或間接攝入受植物源污染食物（蜂蜜、雞蛋、牛奶、茶葉、肉類等），都會對人體造成不可逆的傷害。鑒于此，世界上已有多個國家和組織制定了植物源食品中PAs的攝入限量標準[15]。世界衛(wèi)生組織（WTO）在1989年就頒布了《IPCS健康與安全指南第26號：吡咯里西啶類生物堿的健康和安全指南》，建議PAs日攝入量不超過15μg/kg[16]；英國毒性研究委員會（COT）和德國聯(lián)邦風險評估研究所（BfR）建議每日攝入量不超過0.007μg/kg bw[17]；歐洲藥物管理局（EMA）限定，PAs的成人日攝入量最高為0.35μg/kg，兒童為0.007μg/kg[18]；歐盟委員會（EU）于2020年12月11日修訂了法規(guī)（EC）No 1881/2006中某些食品PAs的最高水平，其中，草藥浸劑為200μg/kg，草本沖劑、茴香等為400μg/kg，茶和調味茶為150μg/kg，含草藥成分的食品補充劑為400μg/kg，花粉及花粉制品為500μg/kg，琉璃苣葉為750μg/kg，小茴香籽為400μg/kg[19]。

為了保護人類健康和安全，植物源樣品中PAs及其PANOs的檢測分析方法的開發(fā)和應用顯得尤為重要。本文綜述了近年來植物中有毒PAs分析方法的應用，包括不同植物中多種PAs的提取、凈化和檢測，通過對植物中PAs不同分析方法的對比研究和展望，旨在為制定植物中有毒PAs的限量標準提供分析技術保障，也為從事相關領域的分析人員提供更簡單、高效和環(huán)保的分析方法，同時為進一步開發(fā)植物中多種PAs的檢測和分析技術提供一定的研究思路。

一、植物中PAs的提取

根據(jù)PAs的結構特征可知，PAs是含有堿性氮的相對極性有機化合物[20]，其作為還原性生物堿，極易被氧化為相應的氮氧化物（PANOs屬于極性分子）。對于植物中PAs的提取，提取溶劑通常采用一些具有較強極性的醇溶液（如甲醇、乙醇），或醇與水的混合溶液。PAs在酸性條件下以離子形式存在于水溶液中，在水中加入少量的酸（如硫酸、鹽酸、酒石酸、甲酸），可提高PAs的水溶性，提高萃取效率[21]。近年來植物樣品中PAs的提取方法有索氏提取、超聲輔助提取、超臨界流體萃取、加壓溶劑萃取、微波萃取。

（一）索氏提取索氏提?。⊿E），是從植物復雜基質中萃取PAs應用最頻繁的經典萃取技術。該方法利用溶劑回流和虹吸原理，通常用于進一步提純或分離步驟前獲得粗植物提取物[22]。H?SCH等[23]通過改變索氏提取的時間對白葉香茶菜中PAs及PANOs的提取效率進行探究，結果表明，在加熱條件下，隨著提取時間的延長，PAs的含量逐漸升高而PANOs的含量卻逐漸下降，回收率由99.5%降到84.1%。因此，在使用索氏提取法提取植物樣品中PANOs時，要注意控溫和提取時間。

（二）超聲輔助提取超聲輔助提?。║AE）是一種基于超聲機械波在液體介質中的空化作用、機械效應和熱效應等產生并傳遞強大的能量，加速胞內PAs的釋放、擴散和溶解，顯著提高提取效率的提取技術[24]。陳麗華等[25]以95%甲醇水作為提取溶劑在常溫下對番瀉葉藥材進行超聲提取30 min，結果表明，14種PAs均有較好的線性關系，回收率為80.60%～103.22%。喬月等[26]利用超聲輔助提取法在室溫下對款冬花中PAs和PANOs提取30 min，平均回收率在71.52%～105.96%，RSD＜5.7%，方法的回收率良好。ZHOU等[27]利用0.05 mol/L鹽酸超聲提取千里光屬植物中7種PAs，回收率在91.4%～110.8%。

（三）超臨界流體萃取由于超臨界流體萃?。⊿FE）中的萃取劑是介于氣液之間的一種既非氣態(tài)又非液態(tài)的物態(tài)，該特性引起研究者的關注[28]。BICCHI等[29]利用離線超臨界流體萃取及毛細管氣相色譜法測定了窄葉黃菀和心形菜蕨中PAs的含量，該方法的回收率為90%～105%，回收率滿足要求。

（四）加壓溶劑萃取加壓溶劑萃取（PSE）是一種采用常規(guī)溶劑，在較高的溫度（50～200℃）和壓力（10.3～20.6 MPa）下對植物源樣品中PAs進行萃取的樣品前處理技術，它與SFE有一些共同原理[30]。KOPP等[22]利用加壓溶劑萃取法在50～125℃和10 MPa下對夏枯草、款冬和鐵皮石斛中PAs和PANOs進行提取，結果表明，在50℃，提取溶劑為5%甲酸的條件下，夏枯草的回收率最高，達到174.4%；在125℃，提取溶劑為1%甲酸的條件下，款冬的回收率最高，達到156.5%；在50℃，提取溶劑為5%硫酸的條件下，鐵皮石斛的回收率最高，達到288.7%。

（五）微波萃取微波萃取又稱微波輔助提?。∕AE），是指使用適當?shù)娜軇┰谖⒉ǚ磻髦袕闹参?、礦物、動物等組織中提取各種化學成分的技術和方法[31]。林麗清等[32]采用微波萃取法對鬼針草中總生物堿進行提取，選擇95%乙醇為提取溶劑，微波功率為40 W，提取30 min，回收率可達100.4%，RSD為0.889%，優(yōu)化后的方法回收率較高，精密度較好。

索氏提取固態(tài)植物樣品可多次與新鮮的提取溶劑接觸，提高了PAs的浸取速率，但索氏提取法萃取時間較長，溶劑消耗量大。超臨界流體的密度較大，增大了其對PAs的溶解性，但超臨界流體萃取過程比較復雜，儀器設備要求較高。加壓溶劑萃取的高壓條件改善了提取溶劑通過基體的通道，高溫降低了提取溶劑的黏度，從而在更短的時間內獲得更好的萃取性能，但儀器設備昂貴，操作過于復雜。微波萃取操作簡單方便，溶劑消耗量較少，提取效率高，但每次可制備的樣品較少，對于植物中PAs的提取具有選擇性，適用范圍小。超聲輔助提取法與以上幾種提取方法相比，具有操作簡單、儀器設備成本低、適用范圍廣、溶劑消耗量少及提取效率高等優(yōu)點，已成為不同植物樣品中快速提取多種PAs的有效方法。

二、植物中PAs的凈化

由于植物基質提取液的成分比較復雜，往往需要對其進行凈化處理。近年來關于PAs從植物基質中凈化的方法主要有3種。

（一）液液萃取液液萃?。↙LE）是一種基于相似相溶原理，根據(jù)PAs在液相之間的溶解度差異進行分離的傳統(tǒng)分離凈化方法。梁威等[33]采用液液萃取法分離純化廣西產千里光藥材中的阿多尼弗林堿（adonifoline），平均回收率為98.9%，RSD為0.70%。由于該方法操作過程比較煩瑣，不能同時分離純化植物基質中的PAs及其氮氧化物，不能滿足現(xiàn)代分析技術對PAs進行痕量分析的要求，因而漸漸被固相萃取法、分散固相萃取法所取代[21，34]。

（二）固相萃取固相萃?。⊿PE）是基于吸附劑與分析物本身之間的相互作用將分析物吸附到固體吸附劑上，因此選擇合適的吸附劑非常重要[35]。常用的SPE柱有C8、C18、SCX，其中SCX的使用可以有效地去除弱極性與離子型極性干擾物質，同時滿足PAs和PANOs的回收率要 求[34，36]。JI等[37]利用固相萃取法對平臥菊三七中11種PAs進行分離純化，分別比較了PCX、SCX和C183種SPE小柱的凈化效果，結果表明，PCX柱的凈化效果最佳，平臥菊三七基質中9種PAs的回收率為84.0%～99.4%。張?zhí)m等[38]采用0.1%甲酸水溶液和SCX固相萃取柱對花茶中5種PAs進行提取和凈化，得到的回收率為89.69%～102.12%，RSD為0.3%～5.4%。

（三）分散固相萃取分散固相萃?。╠SPE）是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。近年新發(fā)展起來的基質分散固相萃取法（QuEChERS法）是一種快速、高效、簡便、安全、綠色環(huán)保及價格低廉的前處理方法[39～40]，其漸漸被用于植物復雜基質中PAs的分離純化。ZBYNEK等[41]采用分散固相萃取法對高粱、牛至和花草茶中33種PAs進行提取凈化，得到高粱中33種PAs的回收率為82%～115%，牛至中為80%～106%，花草茶中為78%～117%，RSD均在19%以下。PIOTR和BOZENA[42]采用超聲輔助改良QuEChERS方法提取和純化薄荷、甘菊、蕁麻和椴樹中30種PAs，發(fā)現(xiàn)添加石墨烯的QuEChERS在超聲輔助提取下，4種植物樣品中的PAs均獲得理想的回收率，范圍為60%～128%，RSD＜17%。

液液萃取法作為一種常規(guī)技術為之后的固相萃取和分散固相萃取的開發(fā)奠定了基礎，但由于其時間長、溶劑要求高等缺點，現(xiàn)在已經很少被用于植物中PAs的凈化。固相萃取可更有效地將PAs與干擾組分分離，縮短樣品預處理過程，在去除雜質的同時，還可實現(xiàn)樣品的富集凈化，提高PAs的回收率。但與QuEChERS法相比，SPE溶劑消耗量較大，耗時較多，價格較為昂貴，且操作復雜。QuEChERS法操作簡單快捷，具有溶劑用量少、提取效率高、純化效果好的特點。

三、植物中PAs的檢測分析

隨著科學技術的發(fā)展，植物中PAs的檢測技術越來越多樣化。近年來植物中PAs的檢測方法有比色法、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫吸附法、色譜法、質譜法、色譜質譜聯(lián)用法。

（一）比色法

1.酸性染料比色法。酸性染料比色法是在一定的介質條件下，PAs可與氫離子結合生成相應的陽離子，然后用分光光度計在一定波長下測定離子對的吸光度，即可對植物中PAs進行定量。BIRECKA等[43]利用硼酸或醋酸溶液使氯仿中的天芥菜堿（heliotrine）、倒千里光裂堿（retronecine）、仰臥天芥菜定（supinidine）和頸花脒（trachelanthamidine）等PAs離子化，得到的萃取液在525 nm的波長下進行檢測，該方法的檢出限（LOD）為0.5 mg/L，定量限（LOQ）為2～15 mg/L。

2.Ehrlich反應比色法。Ehrlich反應比色法是利用Ehrlich試劑（4－二甲氨基苯甲醛）與經衍生化PAs的吡咯衍生物進行顯色反應生成相應的絡合物，該物質在特定波長下有著強烈的光吸收，用分光光度計在該波長下進行測定的方法。梁威等[33]用該方法測定了廣西千里光藥材中阿多尼弗林堿的含量，Ehrlich試劑與衍生物發(fā)生顯色反應，生成酒紅色的物質，回收率為98.9%，檢出限為1.02 mg/L，RSD為0.70%。

（二）毛細管電泳法毛細管電泳法（CE）是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，根據(jù)植物樣品中各組分間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)PAs分離和測定的方法。YU等[44]用動態(tài)pH連接掃描毛細管電泳法測定了中草藥款冬中4種有毒的PAs，結果表明，PAs敏感度增強23.8～90.0倍，檢出限可達0.03 mg/L，該方法還同時檢測了樣品基質類型、pH和鹽濃度等關鍵因素。

（三）酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是利用PAs與酶標記抗體間特異性的免疫反應以實現(xiàn)對植物中PAs進行定性定量檢測的免疫學技術。BOBER等[45]用競爭性酶聯(lián)免疫吸附法測定了倒千里光裂堿和野百合堿（monocrotaline），該方法對倒千里光裂堿有更好的競爭性，其在490 nm下讀數(shù)成線性關系，相關系數(shù)為0.99，檢出限為0.2 mg/L。

（四）色譜法

1.薄層色譜法。薄層色譜法（TLC）是根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對照物所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以測定植物樣品中PAs含量的方法。TOMASZ等[46]以薄層掃描結合離子對高效液相色譜的方法，同時測定了聚合草、款冬等6種植物中倒千里光堿（retrorsine）、倒千里光堿氮氧化物（retrorsine-N-oxide）、克 氏千里光堿（senkirkine）、千里光菲靈堿（seneciphylline）和千里光寧堿（senecionine）的含量。該方法在220 nm波長下掃描，方法的檢出限為0.06～0.10 mg/L，定量限為0.20～0.35 mg/L，RSD為1%～3%。

2.超臨界流體色譜法。超臨界流體色譜法（SFC）是以超臨界流體（如二氧化碳等）作為流動相結合特定的檢測器對植物中PAs進行檢測的一種色譜方法。HOLZER等[47]采用毛細管超臨界流體色譜法檢測了千里光植物中8種PAs，該方法分離效果好，靈敏度高，檢出限可達1.0 mg/L。

3.氣相色譜法。氣相色譜法（GC）是利用載氣作流動相實現(xiàn)對植物樣品中PAs分離測定的分析方法。NICHOLAS等[48]利用GC－NPD法測定了聚合草中西門肺草堿（symphytine）和藍薊定（echimidine）的含量，對于西門肺草堿，其檢出限為0.1 mg/L，藍薊定的為0.1～0.4 mg/L，線性相關系數(shù)為0.99。

4.液相色譜法。液相色譜法（LC）是用液體作為流動相來實現(xiàn)對植物樣品中PAs分離測定的方法。寧娛等[49]通過高效液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測器（HPLC－DAD），采用Kromasil RP－C18色譜柱，以乙腈和水（0.1%磷酸+0.4%三乙胺）為流動相，在220 nm波長下對一點紅中的克氏千里光堿的含量進行檢測，結果表明，克氏千里光堿的含量為0.15～0.81 mg/L，平均含量為0.40 mg/L。

（五）質譜法質譜法（MS）是在電場和磁場雙重作用下將PAs打成碎片離子，根據(jù)分離后不同特征碎片離子的質荷比對PAs進行檢測分析的方法。CHEN等[50]采用實時質譜法（DART－MS）快速鑒別和測定了菊三七中6種具有代表性的PAs，該法在正離子模式下掃描，質荷比設置為150～1 000，得到了方法的檢出限為0.55～0.85 μg/L，定量限為1.83～2.82μg/L，RSD＜10%。此外，DART－MS的檢測結果與HPLC－MS的檢測結果基本一致，證實了該方法的準確性。

（六）色譜質譜聯(lián)用法

1.氣相色譜與質譜聯(lián)用法。氣相色譜與質譜聯(lián)用法（GC－MS）已越來越多運用于PAs的檢測分析中。MICHAEL等[51]通過GC－MS測定了臭狗舌草、藍薊和蝴蝶蘭花粉中1，2－不飽和PAs及其PANOs，該法在SIM模式下進行測定，結果計算為單一倒千里光裂堿當量，檢出限為0.003 mg/L，定量限為0.01 mg/L。

2.液相色譜與質譜聯(lián)用法。液相色譜與質譜聯(lián)用法（LC－MS/MS）是在單一液相色譜法檢測器不能對PAs達到很好的檢測靈敏度的背景下提出的。液質聯(lián)用儀采用的離子源常為大氣壓化學電離離子源（APCI）或電噴霧離子源（ESI），后者應用比較廣泛，常用于極性較強的PAs和PANOs的痕量分析。APCI在流動相pH為9～10時，其電離的靈敏度急劇增加，對游離PAs分析有良好的穩(wěn)定性，但其對極性的PANOs的靈敏度較低，不適用于PANOs的痕量分析[20]。喬月等[26]采用UPLC－MS/MS法同時測定了款冬花中15種PAs及其PANOs。該方法的離子源采用電噴霧正離子模式，根據(jù)PAs和PANOs的碎片化路徑，在MRM模式下篩選出PAs和PANOs的前體離子，方法的檢出限為0.010 8～0.218 0μg/L，定量限為0.089 7～0.592 1μg/L，RSD為2.8%～9.0%，生物堿的回收率在68.10%～105.96%。

上述LC－MS/MS研究中多使用目標MS/MS設置，對于檢測無對照標準品的PAs及其PANOs具有很大的局限性和不確定性。為解決上述問題，研究者進一步開發(fā)了液相色譜與高分辨質譜聯(lián)用技術（LC－HRMS），使用高分辨質譜可以全面獲取樣品中未知PAs的精確相對分子質量和碎片離子信息，實現(xiàn)對未知PAs的結構及PAs的同分異構體篩選鑒定和痕量分析[52]。ALEXANDER等[53]采用UPLC－ESI－TOF－MS對綠穗莧提取物中的5種PAs進行定性定量分析，采用電噴霧正離子源模式，質譜采集范圍為50～600 Da，使用0.5 ng/mL亮氨酸腦啡肽溶液進行實時質量校正，所得PAs的定量限為2μg/L。JEONG和LIM[54]使用UPLCESI－Q－TOF－MS法快速準確測定了琉璃苣、款冬、紫草、聚合草中9種PAs，該法在電噴霧正離子源模式下，掃描時間設置為0.25 s，以獲取m/z在50～1200的數(shù)據(jù)，可準確提供PAs前體和碎片離子質量信息并能夠同時完成對其定量分析，檢出限為0.4～2.0μg/L，定量限為0.6～6.0μg/L。此外，還表征了70種PAs及PANOs的前體離子及其生成的特征碎片離子，對于未知PAs的鑒定和痕量分析提供了參考數(shù)據(jù)。

比色法、CE、TLC和SFC是早期研究者常使用的方法，對于濃度較低的植物材料來說，往往不能準確完成定量。ELISA和MS的靈敏度高，極大地縮短了檢測時間，能完成定性和定量分析。但ELISA試劑盒昂貴，有時也會有假陽性出現(xiàn)，MS單獨使用效率較低。GC、GC－MS和LC可以對復雜植物基質多種PAs完成分離和測定，但GC和GC－MS不適用于PANOs的分析，且衍生化煩瑣、耗時，可能發(fā)生生物堿的雙酯化；LC的紫外最大吸收波長常超出檢測器的范圍，使檢測靈敏度大大降低。為解決上述問題，研究者在目標MS/MS設置的基礎上開發(fā)了LC－HRMS，利用HRMS不僅可實現(xiàn)對不同結構的PAs和PANOs進行定性定量分析，還可準確提供未知PAs前體和碎片離子質量信息并能夠同時對其痕量分析，其檢測范圍廣，分析時間短，具有高靈敏度和更低的檢出限，能達到WTO、COT、BfR和EU等權威組織和機構制定的限量標準。

四、展望

隨著科學技術的不斷進步，植物樣品中PAs的檢測分析技術也在不斷地發(fā)展和完善。高靈敏度和高選擇性的液相色譜與高分辨質譜聯(lián)用技術開發(fā)成為今后PAs檢測技術的主要發(fā)展方向。對于不同的植物樣品和不同結構類型PAs及PANOs，在分析時應充分考慮樣品的特點，包括植物的分類（科、屬、種）和生長期。不同種類植物的特征有較大差異，如形態(tài)特征、顏色、水分含量等都會對提取和凈化有不同的要求，木質化的植物前處理較為麻煩，需要進行預處理（粉碎、研磨等）；細胞色素含量較高的植物還需凈化去除色素；水分含量較大的植物需要烘干后再進行前處理。同種植物在不同生長期，其形態(tài)結構和水分含量也有較大差異，在分析測定時應根據(jù)各生長期的特點選擇合適的前處理方法。

目前，研究者多采用超聲輔助QuEChERS方法提取凈化植物樣品中的PAs，并根據(jù)不同研究對象和生物堿的特點，對超聲（超聲時長、頻率、溫度等）和QuEChERS條件（吸附劑的組合、用量等）進行優(yōu)化，形成高效可選擇性的前處理方法。改良超聲輔助分散固相萃取結合超高效液相色譜與高分辨質譜聯(lián)用法的應用，可為植物源樣品中多種PAs分離和定性定量檢測提供技術支持，為進一步完善PAs在農產品中限量標準的制定和毒理評價方面的研究提供技術指導，為進一步消除PAs污染農產品隱患、加強農產品質量安全提供技術保障。