量子點對秀麗隱桿線蟲的毒性效應及其調控機制的研究進展

程錦，季倩倩，王瀚，吳添舒

環境醫學工程教育部重點實驗室，東南大學公共衛生學院，南京 210009

隨著納米技術的快速發展，量子點(quantum dots, QDs)作為一種新型的納米熒光探針和納米載體，由于其獨特的性質，如優異的耐光漂白性、相對較長的熒光壽命、修飾后良好的生物相容性等被廣泛應用于各個領域[1]，但是現有研究發現，許多類型的量子點可以滲透到組織和細胞中，并導致生物體內的生化損傷。因此，明確量子點的毒性效應及其毒作用調控機制是控制量子點毒性的關鍵之一。秀麗隱桿線蟲作為一種經典的模式生物，具有諸多優點，包括良好的生物學基礎，較短的生長周期和較大的繁殖規模，已被廣泛應用于毒理學領域，尤其是環境毒理學[1]。并且，秀麗隱桿線蟲基因組中約有40%基因與人類基因組同源，因而外源化學物對秀麗隱桿線蟲的毒性效應很大程度上可以反映毒物對脊椎動物，甚至是人體的損傷。在此研究背景下，本文總結分析了新近發表的文獻，旨在闡述量子點對秀麗隱桿線蟲的毒性效應及其調控機制的研究進展。

1 量子點在生物體內的ADME(absorption, distribution, metabolism, excretion)過程(The ADME process of quantum dots in organisms)

1.1 量子點被機體的吸收

量子點主要的暴露方式有短期暴露和長期暴露[2]。硫化鋅外殼修飾的碲化鎘量子點(CdSe/ZnS)和碲化鎘量子點(CdTe)是生物成像中最常用的2種納米粒子，一些研究表明，把與CdTe量子點、CdSe/ZnS量子點混合后的大腸桿菌喂食給秀麗隱桿線蟲，短期暴露12 h后，大量量子點與大腸桿菌一起通過消化道被攝入，并填滿咽腔，以極短的速度經過腸道，許多量子點保留在腸的初始部分，在中間腸中與大腸桿菌分離。同時，大多數量子點通過肛門和外陰排出體外，僅有少數量子點殘留在消化系統和生殖系統中，并未進入卵中[3]。暴露24 h后，發現腸道內的CdSe/ZnS量子點的ZnS外殼被破壞，CdSe核被氧化[4]。暴露16 d，量子點在消化系統中不斷積累，被腸細胞大量吞噬。除量子點以外，相關研究表明其他的熒光納米材料也具有相似的吸收過程[5-6]。

1.2 量子點在機體內的分布

相關研究表明，大多數類型的量子點，無論在無機核和有機穩定劑中的組成如何，都在秀麗隱桿線蟲中表現出相似的生物分布[3]。進入機體的量子點在線蟲體內各個系統中均有分布，主要分布在腸道系統。吳添舒等[7]的研究表明，當線蟲暴露于不同濃度的CdTe量子點24～72 h后，被攝取的量子點主要聚集于腸道中。線蟲頭部也有量子點的分布[8]，可能是通過腸道生物膜而進入相鄰的頭部細胞。而較長的暴露時間(72 h)也導致了量子點在體內更多的集聚。相關研究表明在線蟲前部的肌肉中也有適量的CdTe量子點聚集[8]。

在消化系統中，量子點主要分布在咽部和小腸[9]，長時間暴露后，內化的CdTe量子點可以散布在咽、腸腔和腸細胞中，并且累積程度隨量子點暴露濃度遞增。附著在咽側壁上的量子點提示其與咽壁細胞可能存在特殊相互作用[10]。

已有研究表明，CdTe量子點和CdSe/ZnS量子點等大小和組成不同的納米材料可能會從消化系統中易位并影響生殖系統，暴露時間的長短也對生殖系統的作用有重要影響。在CdTe和CdSe/ZnS量子點中短時間暴露(12 h)后，大多數量子點通過肛門和外陰排泄到外部，并且在生殖系統中僅觀察到少量量子點，而沒有進入卵。暴露12 h～3 d時后，量子點從消化系統轉移出來，線蟲還未觀察到明顯的不良反應。然而，繼續暴露到16 d時，大量量子點轉移并積聚在線蟲子宮和外陰，從而對生殖系統產生不利影響并損害卵子[3]。胚胎死亡率和產卵缺陷的增加可能歸因于運動神經元中跨神經突觸的傳遞受阻[11]。

在神經系統中，也觀察到量子點的分布。Wu等[11]研究了線蟲中氧化石墨烯量子點在線蟲中的易位和生物分布。從L1幼蟲到成蟲第8天長期暴露于1 mg·L-1的氧化石墨烯量子點后，仍可以在咽中檢出標記的氧化石墨烯量子點，大量氧化石墨烯量子點轉移到了咽周圍的頭部大多數神經元所在的位置以及性腺和線蟲中的某些胚胎中。此外，與咽、性腺和胚胎中累積的氧化石墨烯量子點相比，更多的氧化石墨烯量子點在線蟲的腸和尾巴中積累。推斷氧化石墨烯量子點可能在慢性暴露后通過線蟲中主要目標器官的屏障轉移到次要目標器官中，例如性腺和神經元。一些研究表明[8,12]，長期暴露后，CdTe量子點沿著腸的生物屏障易位到RMEs運動神經元(RMEs motor neurons，包括RMED、RMEV、RMEL和RMER)中，尤其是在線蟲頭部。而CdTe/ZnS量子點主要分布在腸道中，沒有在RMEs運動神經元中觀察到CdTe/ZnS量子點的熒光信號，表明ZnS涂層可以防止CdTe量子點穿過腸屏障并轉移到RME運動神經元中。

線蟲的排泄系統由4種獨特的細胞類型組成，它們參與滲透/離子調節。當排泄系統受損時，線蟲會因過量的液體膨脹而迅速形成“桿狀”致死表型，很容易識別[13]。排便是在神經系統的控制下，并通過節律性激活肌肉收縮循環來實現[14]。Wu等[8]研究發現，長期暴露于濃度為5～20 mg·L-1的CdTe量子點，顯著降低了線蟲的泵吸率，增加了線蟲的平均排便周期，可觀察到線蟲腸道內脂肪存儲量增加。Wu等[11]通過檢測氧化石墨烯量子點與大腸桿菌(EscherichiacoliOP50,E.coliOP50)在線蟲體內的共定位，發現氧化石墨烯量子點暴露第8天時，可以在成年線蟲的前部區域和后部區域，尤其是尾部的排便結構區域，觀察到氧化石墨烯量子點與OP50的共定位和OP50的非正常過度積累，推斷的線蟲的正常排便行為可能受到了石墨烯量子點干擾。

進入到生物機體內的量子點還可能進一步進入并在細胞內環境中分布和聚集。Wang等[15]的研究表明，一些量子點可以進入臨近的腸細胞，到達細胞內溶酶體并被其保留，并且量子點大小差異似乎并不影響量子點的亞細胞定位。

1.3 量子點在機體內的代謝和排泄

隨著暴露時間的延長，量子點可以在消化系統中積累，并在消化微環境中整合新陳代謝。Qu等[3]的研究表明，由于內部硒的氧化作用，CdSe/ZnS量子點降解，發生熒光猝滅，導致有毒金屬離子(Cd和Se)的釋放。Xu等[16]在研究中同樣觀察到碳量子點在線蟲體內的熒光猝滅現象。Tian等[17]的研究表明，CdSe量子點隨細菌被攝入后，從口腔、咽部腔、腸道最終到達線蟲的直腸，部分量子點從線蟲的肛門中排出。量子點暴露6 h后，腸腔中的量子點明顯增多；暴露12 h后，量子點在腸道內腔中變得更加豐富，研究者同時觀察到CdSe量子點向Se和Na2SeO3的部分轉化。在此過程中，一些分散的量子點甚至進入到了鄰近的腸細胞。

2 量子點對秀麗隱桿線蟲的主要毒性效應(The main toxic effects of quantum dots on Caenorhabditis elegans)

根據量子點進入生物體后的分布和情況，研究者預測量子點可能對線蟲的多個組織系統產生毒性效應。得益于多種分子生物學技術和轉基因線蟲的應用，量子點導致線蟲毒性效應的分子調控機制也能得到很好的研究。將線蟲用于量子點毒性研究的相關規劃總結在圖1中。

圖1 將秀麗隱桿線蟲應用于量子點(QDs)毒理學研究的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of using nematodes C. elegans in the toxicology study of quantum dots (QDs)

2.1 腸道毒性

腸屏障是線蟲阻止某些二維碳基工程納米材料進入線蟲的次要靶向器官的重要生物屏障。Liu等[18]的研究表明，當線蟲暴露于氧化石墨烯量子點時，腸道屏障的生理功能狀態發生失調。長時間接觸氧化石墨烯量子點會導致腸屏障處于高滲透狀態，導致平均排便周期長度增加、腸道脂肪增加等病理改變，腸道發育和排便行為所需的基因也會發生改變[2]。氧化石墨烯量子點還能進一步在腸道微絨毛消失的情況下轉移到腸細胞中，并分布在細胞內線粒體附近或周圍。

2.2 神經系統毒性

成年秀麗隱桿線蟲有302個神經元和7 000個突觸，屬于2個不同且獨立的神經系統。Zhao等[12]研究發現，長期暴露于0.001 μg·L-1和0.01 μg·L-1的CdTe量子點不會引起線蟲異常的覓食行為，而線蟲的覓食行為通常由特定神經元控制。當CdTe量子點濃度增加到0.1 μg·L-1和1 μg·L-1時則誘導秀麗隱桿線蟲異常覓食行為的形成。長期暴露于一定濃度的CdTe量子點中可引起RMEs運動神經元的發育和功能障礙。

除了含鎘量子點，Zhang等[19]研究發現，氧化石墨烯量子點可以減少線蟲壽命，并減緩線蟲的運動行為。壽命和運動行為的改變反映了氧化石墨烯量子點對線蟲的神經毒性。張從芬等[20]的研究表明，CdS/ZnS量子點暴露對秀麗隱桿線蟲的體長、頭部擺動以及身體彎曲等生物行為有不同程度的抑制作用。吳添舒等[7]的研究表明，CdTe量子點暴露可以抑制線蟲的運動行為、咽泵運動和排便，降低學習和記憶能力，表現出一定的神經毒性。而量子點的神經毒性作用可能與其影響神經遞質谷氨酸、五羥色胺和多巴胺的轉運體和受體相關。Wu等[11]研究發現，長期暴露于1 mg·L-1氧化石墨烯量子點顯著降低了線蟲體內控制排便行為的AVL和DVB神經元細胞體的相對熒光強度，并觀察到氧化石墨烯量子點與AVL和DVB神經元共定位，推斷氧化石墨烯量子點可能對AVL和DVB神經元造成了直接損害，從而導致線蟲排便周期的延長。

2.3 免疫系統毒性

秀麗隱桿線蟲不存在高等生物的適應性免疫，只能靠先天免疫發揮作用。其中，DBL通路、DAF-2/DAF-16通路、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路、Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)信號通路以及一系列免疫相關基因構成的復雜的信號網絡，調控著線蟲的先天免疫[21]。免疫反應的損害為量子點在正常條件下對秀麗隱桿線蟲的影響提供了至關重要的基礎。Wu等[11]研究發現，慢性氧化石墨烯量子點暴露可誘導編碼抗微生物肽的F08G5.6、pqm-1、K11D12.5、prx-11、spp-1、lys-7、lys-2、abf-2、acdh和nlp-29等基因表達水平顯著降低，并改變編碼p38 MAPK激酶信號轉導通路中關鍵基因的表達，導致線蟲對病原體的免疫應答能力下降，從而出現壽命下降等一系列毒性效應。周炎烽[22]研究發現，CdTe量子點可以引發線蟲發生細胞自噬，進入秀麗隱桿線蟲體內的量子點可以誘導線蟲體內形成明顯的自噬體，同時上調自噬相關基因、降解自噬底物，表明納米顆粒誘導自噬的能力與它們對膜狀亞細胞結構造成損傷的能力相關。

2.4 生殖系統毒性

線蟲分為雌雄同體和雄性，其中，雄性比例極低，一些研究表明量子點的暴露對雌雄同體線蟲存在生殖毒性。Hsu等[23]的實驗表明，雌雄同體線蟲暴露于濃度為1 μmol·L-1的CdSe/ZnS量子點時會導致成蟲子宮內胚胎數量增多并出現過早產卵，產卵死亡率上升，增加產卵缺陷表型，其機制可能與量子點破壞了控制線蟲產卵活性收縮的特定運動神經元(hermaphrodite-specific neurons, HSNS)相關。Qu等[3]的研究表明，CdTe量子點暴露12 h和3 d時，雌雄同體生殖系統的不同部分通過上皮、基底層或性腺鞘與消化系統和假體分開，與鞘細胞相比，量子點很容易穿透上皮，因此在性腺中幾乎沒有觀察到量子點。但是長期暴露16 d時，大量量子點轉移并積聚在子宮和外陰，對卵造成一定的損傷，導致野生型雌雄同體線蟲的繁殖力下降。這說明，量子點慢性暴露依然存在生殖毒性。Qu等[10]的實驗表明，排除CdTe量子點釋放出的Cd離子造成的影響后[24]，長期暴露于CdTe量子點顆粒(≥50 mg·L-1)會導致野生型線蟲生殖能力缺陷，生殖細胞的增殖和分化失調，減數分裂異常，受精卵的生成和排出減少，育雛量和產卵率下降，導致卵子發生失衡。Contreras等[25]研究了暴露于CdTe和CdTe/ZnS量子點中的秀麗隱桿線蟲的多代適應性和耐受性。與溶解的Cd暴露相比，未涂覆的CdTe量子點暴露會對秀麗隱桿線蟲產生類似的急性影響，例如壽命縮短和育雛尺寸減少，而未觀察到CdTe/ZnS量子點的影響。在研究量子點暴露對雄性線蟲的生殖系統影響時，Qu等[3]觀察到在量子點短期暴露時，雄性線蟲外陰增大，可能導致其在交配過程中性腺無法正常受精。

2.5 細胞毒性作用

多年來的毒理學研究已經明確了CdTe量子點的細胞毒性[26]，而進入到線蟲體內的量子點同樣有可能導致生物機體內細胞的損傷。Wang等[15,27]的實驗結果表明，量子點破壞了線蟲腸道細胞的內吞循環和營養儲存功能，可能是導致秀麗隱桿線蟲的生長狀態惡化和壽命縮短的主要原因。量子點暴露誘導了線蟲細胞自噬體形成、自噬相關基因上調和自噬底物降解[27]，并且觀察到大量的內體聚集，內體聚集的嚴重程度與生長抑制和壽命縮短的嚴重程度一致，這表明量子點對秀麗隱桿線蟲發育和壽命的毒性可能是由細胞內吞作用的破壞引起的[15]。根據暴露后腸道脂滴數量的變化，發現量子點可以導致嚴重的營養剝奪，這可能是抑制線蟲生長激素分泌的最終原因[15]。

3 量子點導致秀麗隱桿線蟲毒性的調控機制(The regulatory mechanism of the toxicity of Caenorhabditis elegans caused by quantum dots)

秀麗隱桿線蟲作為一種良好的模式生物，對環境毒物敏感性較高，且具有生命周期短、實驗操作便捷等優點，近年來被用于研究包括量子點在內的多種納米材料的毒性響應機制。其中，主要的毒性機制包括氧化應激損傷、影響細胞自噬、離子通道門控改變損傷、影響分子信號通路、炎癥反應損傷和重金屬離子釋放導致的毒性等。

3.1 氧化應激損傷

氧化應激損傷是量子點誘導秀麗隱桿線蟲毒性的重要機制之一，當生物體受到外來刺激產生的大量自由基不能被及時清除時，體內的氧化還原平衡被打破，未被清除的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)會對細胞大分子和細胞功能產生嚴重損傷。研究表明，ROS造成的氧化損傷最早作用于細胞內線粒體，使其結構和通透性被破壞，進而導致細胞出現損傷[28]。

3.2 細胞自噬

自噬是細胞降解的重要生物學過程，電鏡分析表明秀麗隱桿線蟲也具有自噬的生物學功能，且該功能在線蟲的生長發育、延長壽命、調控程序性細胞死亡、調控神經退行性疾病等多方面起著重要作用。

目前，量子點已經被發現具有誘導細胞自噬的能力。Wang等[15]通過基因水平的實驗發現碳量子點能夠引起線蟲的自噬反應。代慧[33]通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)實驗證實了氧化石墨烯誘導的線蟲自噬過程。此外，雖然正常細胞的自噬可能導致一系列嚴重的健康傷害，但是量子點誘導細胞自噬的能力提示了其在抗腫瘤和癌癥治療等方面具有一定的應用價值。Chen等[34]通過小鼠實驗證實氧化石墨烯量子點可以加速腫瘤細胞的死亡以抑制腫瘤發展。鐘文英等[35]通過細胞實驗證實CdTe量子點可作為自噬增敏劑用于逆轉腫瘤細胞的耐藥性，為增強已有藥物的藥效提供了新的思路。

3.3 離子通道門控改變

離子通道的正常開放與關閉是機體正常生命活動的重要基礎，其中，鈣離子既參與細胞的分化又介導細胞的死亡過程，控制多種生命活動；而鈉離子通道在神經系統的正常運轉中發揮著重要作用，是興奮細胞中動作電位的重要生理基礎。

唐明亮[36]采用鈣成像等實驗方法發現了量子點的急性暴露可以長時間提高細胞內鈣水平，最終導致細胞壞死和凋亡。此外全細胞膜片鉗的實驗結果也顯示，在量子點的刺激下，Ca2+既可以通過鈣通道進入胞內，也可以通過鈉通道流入胞內，再加上另一部分通過鈉通道流入胞內的Na+，共同使得神經系統失調。

3.4 影響分子信號通路

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K-Akt)信號通路和MAPK信號通路均參與突觸可塑性，且與炎癥反應和細胞凋亡密切關。Zhang等[37]通過體外細胞培養的實驗發現，CdTe量子點可以通過激活PI3K-Akt信號通路進而促進細胞凋亡。郝明路[38]通過分子、細胞核動物實驗綜合分析發現，疏基丙酸修飾的CdTe量子點可以誘發細胞凋亡，這與MAPK信號通路的激活密切相關。此外，通過對大鼠海馬體進行轉錄組測序得出的PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路只是目前已經被證實的信號通路[39]，并不排除Toll樣受體通路中存在其他與量子點毒性作用效應相關的信號通路。

3.5 釋放重金屬離子

目前廣泛使用的半導體量子點通常含有如Cd、Hg和As等重金屬成分，且在紫外光照射等因素作用下會釋放出游離的重金屬離子，因而重金屬離子釋放也是量子點產生毒性的重要機制之一。Derfus等[40]的實驗研究表明，被硫基乙酸修飾的CdSe量子點可以釋放Cd2+，進而導致肝細胞死亡。此外，最新的研究發現，硫化物源可通過清除自由基的方式以抑制量子點中重金屬離子的釋放，并起到緩解細胞毒性的作用[41]。

4 量子點對秀麗隱桿線蟲毒性大小的影響因素(Factors affecting the toxicity of quantum dots to Caenorhabditis elegans)

4.1 染毒濃度和染毒時間

近年來，多項實驗結果表明，染毒濃度與量子點濃度有著直接的關系且細胞的活性隨著CdTe量子點濃度的增加而逐漸降低[39]。此外，在相同實驗條件下，細胞活性也隨著染毒時間的增加而逐漸下降[39]。

4.2 尺寸和粒徑大小

4.3 表面電荷

有研究表明量子點的表面電荷同樣會影響細胞的活性，Feswick等[42]通過模擬納米顆粒在不帶電、帶正電荷和帶負電荷的3種CdTe/ZnS量子點暴露下的吸收情況，發現帶負電荷CdTe/ZnS量子點暴露下的納米顆粒吸收程度更大。

5 總結與展望(Conclusion and prospect)

秀麗隱桿線蟲作為體內模型已經成功地應用于評估量子點的潛在毒性，但是鑒于線蟲本身特色和納米毒理學的復雜性，應用秀麗隱桿線蟲進行量子點毒理學研究的優勢以及局限性總結在表1中。總體來說，量子點的毒性大小與量子點的暴露方式、尺寸和修飾材料、表面電荷息息相關，此外，在評估秀麗隱桿線蟲中量子點的生物安全性時，需要考慮一些關鍵因素。在進行遺傳分析時，重要的是選擇2個或更多個候選物作為參考基因，其可以為秀麗隱桿線蟲中的納米毒理學研究產生更可靠的結果。總體而言，使用秀麗隱桿線蟲模型作為多重靈活平臺不僅用于監測量子點的體內結果，而且還用于模擬體內環境。秀麗隱桿線蟲的研究結果提供了有助于了解量子點潛在風險的信息，特別是在環境水平上。不僅僅是量子點，其他納米材料的毒性也將以秀麗隱桿線蟲為模型獲得更加確切的體內毒性評估結果。

表1 應用秀麗隱桿線蟲進行ODs毒性研究的優劣勢Table 1 The strengths and weaknesses of applying nematodes C. elegans in studying toxicity of QDs

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