水產動物模型的建立及在病害防控上的研究進展

陳佳明，王慶，王英英，曾偉偉，尹紀元，李瑩瑩

1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業農村部漁藥創制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣州 510380 2. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306 3. 佛山科學技術學院， 廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室， 普遍高校動物分子設計與精準育種重點實驗室，生命科學與工程學院，佛山 440605

隨著世界人口的快速增長和工業化所帶來的農用土地面積減少，傳統的種植與畜牧業已不能滿足人類日益增長的食物需求。與此同時，魚類及其他水產生物正成為人類重要的食物來源[1]。在過去的30年里，水產養殖業取得了令人矚目的進展，為世界上大部分人口提供了高質量的蛋白質。我國是水產養殖大國，是世界上唯一一個水產養殖產量超過捕撈產量的國家[2]。水產養殖業是推動我國漁業持續、快速和穩定發展的重要力量[3]。然而，魚類病害問題發生頻繁，造成了嚴重的經濟損失，是我國目前水產養殖業發展的阻礙之一[4-5]。因此魚類疾病的防控成為了水產養殖業發展所面臨的重要問題。

傳統的魚類疾病防控方法是直接以受感染的魚類為研究對象，尋求可控制該種疾病的方法。然而，一些魚類養殖條件差異大、遺傳背景不清楚，且國內無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)實驗動物，實驗結果可信度較低，有時還會因為病原感染而影響結果的判斷，阻礙了魚類疾病的有效防控[6]。水產動物模型是人工培育出來的動物，其種源、飼養管理、繁殖生產、生活環境和營養飼料都有系統嚴格的科學要求，是遺傳背景明確和來源清晰的，可用于替代其他生物進行生產、科學研究和檢定等的動物[7]。近年來，水產動物模型逐漸應用于魚病防治研究，借助水產動物模型為水產動物疾病的病原菌毒力分析、病原檢測、傳播途徑研究及綜合防治等提供有力的證據。例如，Rakus等[8]的研究表明，斑馬魚可作為鮭魚呼腸孤病毒(chum salmon reovirus, CSV)和2種同種異型皰疹病毒(cyprinid herpesvirus 1, CyHV-1；cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)的研究模型，利用斑馬魚動物模型，可以評估病毒清除過程，并在CSV-受感染的魚中，可以研究宿主與病原體的長期對抗。Das等[9]以劍尾魚為動物模型，研究水質和環境因素的變化對魚類的健康和疾病易感性，表明氣單胞菌(Aeromonas)是魚類的主要病原體，證實了維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)的高致病性。水產動物模型的建立，將有效緩解魚類疾病防控面臨的諸多不便。

本文主要論述水產動物模型的建立方法，及其在魚類疾病病原分析、水產疫苗開發和水質監測等方面的應用，為水產動物模型的應用推廣提供參考。

1 水產動物模型的建立方法(Establishment method of aquatic animal model)

1.1 模型動物的選擇

模型動物在試驗研究中有雙重作用，它既是研究對象，又是研究手段，在闡明動物疾病機理、預防及治療等一系列的研究中都起著至關重要的作用[10]。建立水產動物模型試驗中模型動物的選擇是重要部分，模型動物的選擇需主要符合以下幾點：(1)可人工培育并能穩定傳代；(2)子代多、世代短和遺傳背景清楚；(3)易于試驗操作。目前常用的水生模型動物有斑馬魚、稀有鮈鯽、青鳉、劍尾魚、新月魚、紅鯽、絲足魚、虹鱒、鯉魚和尼羅羅非魚等。

1.2 建立水產動物模型的原則

1.2.1 相似性

建立水產動物模型的目的是找出可以推廣并應用于水生動物疾病研究的有關規律。然而，模型動物并不是水產養殖中的實際患病動物，因此應盡可能找到患病情況與實際患病動物近似的模型動物，即相似性。為了辨別所找到的模型動物是否與自然情況下的實際患病動物患病情況近似的一致，需要對模型動物進行病理學研究。例如，Renshaw等[11]建立了可通過產生特定嗜中性粒細胞的啟動子下表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的轉基因斑馬魚體內模型，用于炎癥反應的遺傳分析，通過對斑馬魚感染炎癥的病原分析，發現斑馬魚的尾部被剪斷后會引起炎癥，而這種炎癥隨后會在與哺乳動物系統相似的時間過程中消退，證明斑馬魚可作為哺乳動物炎癥診治的水產動物模型。

1.2.2 重復性

理想的動物模型應具有良好的重復性[12]。例如，Tao等[13]和Guan等[14]都利用稀有鮈鯽模型，研究了水中雙酚A對魚類的影響。

1.2.3 適用性和可控性

所用的動物模型可人為地控制一些試驗條件，以便于突出表現該疾病主要病癥。用于醫學試驗研究的模型，應考慮到今后的臨床應用以便于控制該疾病的研究發展，也利于該疾病模型研究的開展[15-16]。例如，筆者所在實驗室以稀有鮈鯽為模型研究草魚呼腸孤病毒，可人為地控制溫度、劑量和攻毒方式等條件，以便于對該種疾病進行研究。

1.3 建立模型動物的方法

1.3.1 自發模型

自發模型是指試驗動物在未經任何的化學處理下，動物自然發生或基因突變產生疾病。以J-db自發糖尿病小鼠模型為例，該小鼠出生即帶有糖尿病致病基因，倪程佩等[17]比較了自發與誘發模型小鼠2型糖尿病的特征，發現8周后自發性2型糖尿病模型糖代謝異常以及炎癥反應都日漸加重，長時間維持高血糖癥狀；誘發性2型糖尿病模型在飼養8周后糖代謝以及炎癥反應部分緩解，高血糖癥狀部分好轉。這證明，自發模型和誘發模型在實驗中可能存在不同研究結果。自發模型是經遺傳育種保留下來的動物，自發模型的建立具有十分重要的參考價值。然而，水產動物模型作為一類新興的動物模型，目前極少存在自發模型的建立，預計在不久的將來，這個領域的研究將會有新的進展。

1.3.2 誘發模型

誘發模型是指試驗者通過一定的化學、物理或生物的致病因素作用于試驗動物，造成患有疾病的動物模型。生物因素致病是目前研究常用的手段，生物因素包括細菌、病毒、寄生蟲、細胞、生物毒素和激素等。如Saraceni等[18]用嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia, AH)感染斑馬魚模型，并通過用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(real-time quantitative PCR detecting system, qRT-PCR)檢測基因表達，分析炎癥相關基因表達，結果表明，斑馬魚可作為嗜水氣單胞菌感染模型。Ahmadifard等[19]以劍尾魚為模型，研究了富集枯草芽孢桿菌的青蒿對觀賞魚的影響，實驗組長期飼喂添加枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的富集蒿屬植物，結果表明，枯草桿菌培養期間濃度為1×105CFU·mL-1的枯草桿菌可以改善劍尾魚的繁殖性能、腸道菌群和對病原菌的抗性。Lin等[20]將草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)通過腹腔注射的方式感染稀有鮈鯽，采用BGISEQ-500對肝胰腺、鰓、頭腎和脾臟4個cDNA文庫進行轉錄組測序，并采用qRT-PCR方法進行驗證，探索發病機制。建立誘發模型的理想目的是在確認水產動物模型的種類、使用藥物、劑量和方法之后，可以容易地再造和重復，同時，這樣的過程也使得魚病預防的方式得到實踐和創新。

1.3.3 遺傳修飾模型

遺傳修飾模型是利用基因克隆、基因敲除和轉基因等技術作用于動物，患有疾病的動物模型。隨著現代分子生物技術在水產動物模型研究中的應用，水產動物遺傳修飾模型的研究正經歷著從宏觀到微觀的過程，從動物模型的群體、個體和細胞水平正向著分子水平方向發展，從分子水平上闡明生命的現象和疾病的本質[6]。Chen等[21]為了研究整合素βl(integrinβl subunit, ITGB 1b)對GCRV的感染作用，以稀有鮈鯽為動物模型，使用CRISPR/Cas9系統產生了ITGB 1b缺失的稀有鮈鯽(ITGB 1b-/-)。GCRV攻毒后，ITGB 1b-/-稀有鮈鯽的存活時間較野生型稀有鮈鯽長，這些發現為GCRV的防治提供了新的研究思路。馮志桐等[22]以轉基因斑馬魚Tg(lyz：EGFP)-Lyz fish為模型探討了重金屬鎘對轉基因斑馬魚的胚胎毒性和免疫毒性，結果表明，轉基因斑馬魚對鎘的免疫性更強，轉基因斑馬魚模型的建立在環境污染物的免疫毒性檢測方面有著重要意義。遺傳修飾水產動物模型是對已知基因加以修飾建立的，能夠作為工具，幫助實現其他目的基因修飾動物模型。遺傳修飾水產動物模型在基因功能和信號通路等生物學基礎研究方面做出了突出貢獻。

2 水產動物模型在魚類疾病防控中的應用(Application of aquatic animal model in fish disease prevention and control)

2.1 水產動物模型在魚類疾病病原分析中的應用

魚類疾病診斷中病原分離和鑒定對疾病防治具有至關重要的作用，回歸感染試驗確定病原致病性是魚病研究中常用的方法，但是一些魚類具有體型大、飼養難、價格昂貴和不易繁殖等特點，阻礙了試驗進行，因此，需用水產動物模型進行相關研究。稀有鮈鯽、斑馬魚、劍尾魚和異育銀鯽等都普遍作為疾病模型應用于魚病病原分析研究，研究要求遺傳背景清晰、來源清楚和雌雄比例相當的1～6月齡魚。1994年，王鐵輝等[23]研究稀有鮈鯽對GCRV的敏感性，通過對感染呼腸孤病毒后的病理觀察，證明稀有鮈鯽對GCRV敏感，可作為抗GCRV育種的模型。2000年，潘厚軍等[24]用18株從淡水魚中分離出來的細菌感染劍尾魚模型，發現細菌對劍尾魚和敏感魚的毒力一致，證明劍尾魚模型作為評價水生細菌毒力的水生動物模型具有較好的前景。2007年，Harriff等[25]用2種海洋分枝桿菌(Mycobacteriumbalnei)感染斑馬魚，分別從魚體的肝臟、脾臟和腸道分離到該細菌。組織病理分析發現，海洋分枝桿菌可以通過腸道感染魚體，在內臟形成肉芽腫。2016年，夏立群等[26]通過對鰤魚諾卡氏菌(Nocardiaseriolea)感染斑馬魚后的病理研究，建立了鰤魚諾卡氏菌感染斑馬魚模型，該動物模型的建立將有助于諾卡氏菌病致病機理的研究和疫苗的研制。2016年，Yuan等[27]以稀有鮈鯽為動物模型，探索Cr6+積累和消除的動態規律，揭示其解毒和抗氧化的機理，對Cr6+中毒稀有鮈鯽進行分析，發現谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白(GST)和金屬硫蛋白(MT)可能參與了Cr6+的解毒作用，此外，Cr6+誘導的稀有鮈鯽GST解毒可能是通過Nrf2介導的基因表達調控完成的。2018年，Rozi等[28]以絲足魚為動物模型，研究來自東爪哇和中爪哇地區水域中5株嗜水氣單胞菌對絲足魚的致病性及組織病理特性，結果表明，3株為致病菌，2株為非致病菌，致病菌的組織病理特性可為感染病原菌的水生動物提供依據。同年，Boucontet等[29]使用亞致死劑量的辛德畢斯病毒(Sindbisvirus)和福氏志賀菌(Shigellaflexneribacteria)來建立病毒和細菌共感染的斑馬魚模型，進行病原分析后發現，病毒誘發Ⅰ型干擾素(IFN)的反應，而細菌引發強烈IL1β和TNFα炎癥反應。與單純感染細菌的魚相比，同時感染病毒的魚死亡率更高，相比之下，先感染細菌后感染病毒并沒有導致死亡率的增加，病毒-細菌共感染的魚中性粒細胞存活受損，在共感染的魚中強烈誘導了2種類型的細胞因子反應。2019年，譚宏亮等[30]以異育銀鯽為動物模型，研究白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌的毒力抑制作用，結果顯示，大黃、虎杖等含白藜蘆醇成分的藥用植物具有效抑制嗜水氣單胞菌毒力、降低魚體炎癥反應的功效；腹腔注射25～100 mg·kg-1白藜蘆醇對感染病原菌的異育銀鯽有一定保護作用，可用于水產細菌病防控。

2.2 水產動物模型在水產疫苗開發中的應用

目前，魚類傳染性疾病的防控主要有免疫預防和藥物控制等方法。其中，由藥物控制引起的變態反應、耐藥性反應和中毒反應等潛在危害很大，對養殖動物、養殖產品、食用者和環境具有嚴重影響；而免疫預防不僅可以提高魚類體內特異性免疫水平，亦能增強其機體抗應激的能力[31]。漁用疫苗的研制與應用一直是水產病害防治的重要研究方向之一，水產動物模型在疫苗研發方面的應用空間十分廣闊。斑馬魚、稀有鮈鯽、劍尾魚和虹鱒魚等常被用作疫苗研發的實驗魚，要求為遺傳背景清晰、來源清楚和雌雄比例相當的1～6月齡魚。2010年，喬遷[32]以劍尾魚作為動物模型，評價大菱鲆紅體病虹彩病毒基因疫苗(pVAX1 25R、pVAX1 47R)對大菱蝦紅體病的治療效果，結果表明，pVAX1 47R疫苗對預防大菱蝦紅體病具有一定的保護作用。2013年，張智慧[33]完成了鰻弧菌減毒活疫苗注射免疫斑馬魚的免疫保護分析，使用疫苗后相對免疫保護率達到90%以上，與在牙鲆等經濟魚種上的結果類似，說明斑馬魚經疫苗免疫后產生跟宿主動物類似的保護作用，可作為疫苗免疫效果評價和保護機理研究的動物模型。2015年，LaPatra等[34]以虹鱒魚為動物模型，研究傳染性造血壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)和腸道紅口病(enteric red mouth vaccines, ERM)的雙重疫苗使用鼻腔途徑接種的情況，結果顯示，通過鼻腔途徑對2種病原體進行雙重接種是一種非常有效的水產養殖疫苗接種策略。2017年，Marana等[35]同樣以虹鱒魚為動物模型，研究沙門氏菌滅活疫苗中抗原濃度對疫苗效力的影響，發現沙門氏菌滅活疫苗中抗原濃度與免疫保護力呈正相關。2018年，Myllym?ki等[36]以斑馬魚為動物模型，用分歧桿菌低劑量腹腔注射感染斑馬魚，研究潛伏性海洋分枝桿菌感染重新激活機制，試驗證明斑馬魚感染模型為研究海洋分枝桿菌感染的再活化機制、篩選疫苗和候選藥物提供了一種可行的工具。2019年，Ramírez-Paredes等[37]以尼羅羅非魚為動物模型，研制了一種弗朗西斯氏菌病(Franciscosis)的全細胞福爾馬林滅活疫苗，接種疫苗840 d后，相對免疫保護率達到100%。

2.3 水產動物模型在水質監測方面的應用

在過去的30年中，世界水產養殖總產量以每年8%的速度增長[38]，到2030年，世界近2/3的水產品將來自于水產養殖業[39-40]。在養殖期間，水生環境為淡水和海洋生物提供了生活環境、食物和氧氣。但由于環境污染、人類活動和農業生產等原因影響水環境中的溶解氧含量、溫度和酸堿度等指標，從而影響水生生物的生長并引起魚類疾病。因此，水質參數的監控調節是水產養殖過程的必要環節。水產動物模型在水質監測中的應用十分廣泛。斑馬魚、稀有鮈鯽、新月魚和青鳉常被用來檢測水毒性，其中稀有鮈鯽的應用最為廣泛，大多選育遺傳背景清晰、雌雄比例相當的幼年或胚胎實驗魚進行各個生命階段的毒性影響研究，或選用成年實驗魚對水體污染物的毒性進行研究。Sadeghi和Imanpoor[41]研究了水體中農藥殘留的各個成分對新月魚模型的影響，證明新月魚可作為水體質量檢測的模型。Yang等[42]以斑馬魚為動物模型，對水中噻唑胺的毒性進行了研究，96 h-LC50值分別為：成魚(4.19 mg·L-1)<仔魚(3.52 mg·L-1)<胚胎(3.08 mg·L-1)，在斑馬魚的這3個階段中感染噻唑胺的癥狀包括異常的自發運動、心跳緩慢、孵化抑制、生長退化和形態畸形，此外，成年斑馬魚暴露于0.19、1.33和2.76 mg·L-1噻唑胺后21 d，肝臟和腎臟有明顯的病理變化。Liang和Zha[43]通過稀有鮈鯽對新型水質污染物苯丙三唑的內分泌干擾作用和神經毒性進行研究，證實稀有鮈鯽是水生毒性試驗和化學安全評價的優良模型動物。Luo等[44]同樣以稀有鮈鯽為模型動物，研究水環境中含氮污染物(氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽)對水生生物早期生命階段的影響，結果表明，氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽對稀有鮈鯽生長無明顯影響的濃度分別為2.49、13.33和19.95 mg·L-1，含氮污染物對稀有鮈鯽的生長構成了威脅，為建立含氮污染物水質標準提供了有益的信息。廖偉等[45]以斑馬魚為動物模型，研究斑馬魚不同生長時期對Cu2+的毒性響應差異，并利用物種敏感度分布法表征不同生長階段斑馬魚對Cu2+的敏感性差異，結果證實，斑馬魚體長、體質量的變化均符合邏輯斯蒂增長方程(R2>0.97)，斑馬魚成魚階段對Cu2+較敏感，而幼魚的敏感性次之，仔魚最不敏感，此研究為水質基準的設計提供了依據。2019年，Guan等[46]通過研究水體中雙酚A對稀有鮈鯽模型脂質代謝的調控機制及卵巢發育的影響，證明稀有鮈鯽可作為水體中雙酚A的檢測模型，是優良的水產毒理學研究的動物模型。

3 前景展望(Prospect forecast)

水生動物模型在科學研究中的建立和應用始于20世紀80年代，1981年Streisinger在Nature發表了一篇有關斑馬魚雌核發育和純系建立的文章，標志著水生動物模型研究的開始[47]。水產動物模型具備遺傳背景清晰、條件可控性強等優點，目前，關于水產動物模型的研究已不再局限于在模型動物群體的研究，基因克隆[48-49]、基因敲除[50-52]、蛋白定位[53-54]、細胞因子[55-56]和轉錄水平[57-59]等分子水平的研究在不斷深入。此外，構建基因突變文庫[60]、轉基因模型生物研究[61]、反向基因篩查技術[62-64]和高通量基因定位[65]等新型研究手段的出現對水產動物疾病模型構建和應用具有較大推動作用。

然而，水產動物模型的標準化研究仍處于初步階段，目前國際認可的應用于疾病研究的標準化水產動物模型僅有斑馬魚、青鳉、黑頭軟口鰷和孔雀魚等。近幾年，我國重視水生模型動物的研究與應用開發，加強選育工作，已陸續開展了劍尾魚、稀有鮈鯽、紅鯽和劍尾魚等優良的水生動物模型的標準化研究，而對于其他模型動物的標準化研究還有待開發。水產動物模型作為一種新手段在水生動物疾病預防研究中具有廣闊的發展空間。

動物模型是醫學、生命科學研究的基礎和重要支撐條件之一，反映了一個國家或地區科技綜合能力的高低，是評價這個國家或地區生命科學水平高低的重要標志之一。水產動物模型具有種類多、繁殖力強和遺傳容易控制等諸多優點，逐漸被應用到水產動物疾病模型復制及病原致病機理等方面研究。最近20多年，世界各國用魚類在魚病防治實驗研究中已取得很多科研成果，發表的科研論文已達數千篇，應用價值已日益為人們所重視。水產動物模型將在水產養殖病害綜合防治中得到愈來愈廣泛的應用。

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