全氟辛烷磺酸(PFOS)對人骨髓間充質干細胞PPARs亞型及分化潛能的影響

鄭璐，潘一帆，秦會，張疆雨，劉薇

大連理工大學環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連 116024

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)具有良好的熱穩定性、疏水和疏油等特殊的理化性質，曾被廣泛用于工業和民用領域數十年[1-2]。PFOS具有環境持久性、高生物累積性、遠距離遷移性和多種毒性作用[3]，在地表水、底泥和灰塵等多種環境介質以及人體中均檢測到PFOS，對生態環境和人類健康造成嚴重威脅。因此，2009年5月斯德哥爾摩公約正式將PFOS列入持久性有機污染物名單[4]。目前環境殘留是PFOS的重要暴露來源，PFOS的毒性機理研究對于其他全氟及多氟烷基化合物(per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs)的研究具有重要參考價值。

由于PFOS與過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)的天然配體脂肪酸的結構相似，使得PPARs成為其毒性作用的首要分子靶標[5]，PPARs包括PPARα、PPARβ和PPARγ這3種亞型。動物實驗發現PPARα是PFASs對嚙齒類動物的主要靶標，是誘導肝腫瘤的重要機制，但人體PPARα的敏感性明顯低于嚙齒類動物[6]，因此根據動物實驗結果評估PFASs的健康風險具有較強的不確定性。此外，PPARs各亞型在調控細胞分化中起到不同甚至相反的作用。PPARγ為脂肪形成的主要調節劑，其表達可促進干細胞/祖細胞的成脂分化并抑制其成骨分化，從而增加細胞脂質水平并減少骨形成[7]。此外，PPARγ激活可促進破骨作用。因此PPARγ在調節骨量和骨代謝中也起到重要作用。與PPARγ相反，PPARβ作為骨轉換的關鍵調節因子，其被激活而抑制成骨細胞介導的破骨細胞生成[8]。因此，研究PFOS與PPARs的相互作用，對于闡明其分子毒理學機制和毒性預測具有重要意義。

傳統毒理學評價動物模型存在倫理學限制、種屬差異和效率低等局限性，腫瘤細胞體外毒性測試體系受異常細胞周期調控等因素影響。人干細胞具有自我更新和多向分化能力，相比動物體內實驗和動物細胞模型與人體健康相關性更強[9-10]。筆者前期研究發現PFOS在人骨髓間充質干細胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMSCs)定向分化條件下，抑制細胞成骨分化，刺激成脂分化，與流行病學調查發現PFOS與骨密度降低以及骨質疏松癥相關的結果一致，提示PFOS對hBMSCs分化的影響研究可準確有效識別該類污染物的毒性機理[11-12]。本研究采用hBMSCs成骨/成脂雙向分化模型，研究PFOS暴露對PPARs各亞型的干擾，及其與干細胞成骨/成脂分化平衡的關聯。研究結果可為揭示PFASs的毒性機理和分子靶標及其健康風險評價提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑材料

PFOS(C8F17KO3S)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、吲哚美辛、茜素紅S、油紅O、十六烷基氯化吡啶和羅格列酮(rosiglitazone, ROSI)購自Sigma-Aldrich。重組人骨形態發生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein 2, BMP2)購自PeproTech。異丙醇購自天津科密歐化學試劑廠。CCK-8試劑盒購自碧云天生物。總RNA急速提取試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司。反轉錄試劑盒和SYBR熒光染料qPCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器

CO2細胞培養箱(NU-4750E，NUAIRE，美國)；光學顯微鏡(YS100，Nikon，日本)；全自動酶標儀(Infinite 200 PRO，Tecan，奧地利)；高速冷凍離心機(Microfuge 20R，Beckman Coulter，美國)；熒光定量PCR儀(Stepone Plus，Applied Biosystems，美國)。

1.3 細胞培養和暴露

hBMSCs、基礎培養基和成骨誘導分化培養基購自賽業生物科技有限公司。細胞在37 ℃和5% CO2條件細胞箱中培養，在實驗室增殖培養至第6代用于本研究。根據流行病學調查中一般人群和職業暴露人群的血液PFOS濃度設定細胞實驗暴露濃度范圍。例如，中國上海299名孕婦臍帶血的血漿中PFOS的最高濃度為0.12 μmol·L-1[13]；美國773名成年人血清中PFOS的算數平均濃度為0.36 μmol·L-1[14]；在位于湖北省的中國最大的PFOS相關產品生產工廠之一，36個工人血清樣本中檢測到PFOS的幾何平均濃度為2.58 μmol·L-1[15]。因此，本研究選擇PFOS暴露濃度為0.1、1和10 μmol·L-1，具有良好的人體暴露相關性。未分化細胞經PFOS暴露7 d后，測定細胞活性和關鍵基因表達水平。

1.4 細胞活性測定

將hBMSCs以4 000個·孔-1的密度接種于96孔板中，每組設置3個平行。在CO2細胞培養箱中培養24 h后，換用含體積比為0.1% DMSO的溶劑對照培養基以及含PFOS的暴露培養基，每3 d更換暴露液。使用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，根據公式計算細胞活性：細胞活性=(暴露組吸光度-空白對照組吸光度)÷(溶劑對照組吸光度-空白對照吸光度)。

1.5 成骨/成脂雙向誘導分化

作為成骨細胞和成脂細胞共同的祖細胞，hBMSCs的成骨和成脂分化之間相互制約抗衡，通過分化平衡維持骨骼紊態，hBMSCs雙向誘導分化是一種常用的干細胞生物學模型，適合于研究外源化學物對細胞分化的影響[16-17]。本研究采用成骨/成脂雙向誘導分化體系，研究PFOS對成骨成脂分化平衡的影響。采用成骨誘導因子BMP2和成脂誘導因子ROSI作為陽性對照。hBMSCs匯合度達100%以上后分別換用含0.1% DMSO、200 ng·mL-1BMP2、500 nmol·L-1ROSI或PFOS的成骨/成脂雙向誘導培養基，混合培養基包含體積比為1∶1的成骨誘導培養基(賽業)和成脂誘導培養基(低糖基礎培養基、10%胎牛血清、1%青鏈霉素、0.5 mmol·L-1IBMX、0.5 μmol·L-1地塞米松和50 μmol·L-1吲哚美辛)，每3 d更換暴露液，共暴露14 d。在細胞分化第14天，分別通過鈣結節形成和脂質形成表征成骨分化和成脂分化水平。用茜素紅染色的方法表征鈣結節形成。吸去暴露液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌。使用體積比為70%的乙醇固定細胞1 h后，再次用PBS洗滌，用40 mmol·L-1茜素紅染液染色細胞20 min，用PBS沖洗。加入10%氯化十六烷基吡啶萃取20 min，將萃取溶液加入96孔板中，用酶標儀在584 nm檢測吸光度。

用油紅O染色表征脂質形成。吸去暴露液，用PBS洗滌。使用4%甲醛固定細胞30 min后，再次用PBS洗滌，用油紅O染液染色細胞30 min，用PBS沖洗。加入異丙醇萃取20 min，將萃取溶液加入96孔板中，用酶標儀在584 nm檢測吸光度。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

將hBMSCs以8×104個·孔-1的密度接種于6孔板中，每組設置3個平行。接種48 h后將基礎培養基分別更換為含0.1% DMSO的溶劑對照培養基或含PFOS的暴露培養基，每3 d更換暴露液。暴露7 d后，使用總RNA急速提取試劑盒進行RNA抽提。以總RNA為模板，使用反轉錄試劑盒進行反轉錄，反應條件為：42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。引物由上海生工合成，以cDNA為模板進行PCR反應，反應條件為：94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，15 s；72 ℃，10 s。每個平行樣本3個復孔進行RT-qPCR分析。以GAPDH基因為內參基因，對目的基因進行標準化，用StepOne軟件進行CT值分析，用2-ΔΔCT法計算基因相對表達倍數。

1.7 基因芯片分析

細胞經0.1 μmol·L-1PFOS或0.1% DMSO連續暴露7 d后，使用TRIzol提取細胞總RNA，按照Affymetrix表達譜芯片的標準流程由上海伯豪生物公司進行微陣列測定[12]。篩選差異表達基因的標準為P<0.05且log2(表達差異倍數)>0.3。使用基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)對差異表達基因進行分析，識別PFOS影響的生物學通路。原始數據已上傳至GEO數據庫(GSE115836)。

1.8 統計分析

數據結果用平均值±標準誤差表示，采用SPSS統計分析軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。用GSEA篩選差異表達基因和通路富集。“*、**”表示兩組之間有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。

2 結果(Results)

2.1 PFOS對hBMSCs未分化條件下PPARs各亞型mRNA表達水平的影響

在0.1～10 μmol·L-1濃度范圍內，PFOS暴露7 d對細胞增殖未產生顯著性影響，細胞存活率均>90%(圖1)。因此，選擇0.1～10 μmol·L-1作為后續研究的PFOS暴露濃度，可避免細胞毒性對機理研究的干擾。在對細胞增殖未產生顯著性影響的濃度下，PFOS暴露誘導hBMSCs細胞中PPARα、PPARβ和PPARγ表達上調(圖2)。在1 μmol·L-1PFOS作用下，PPAR各亞型mRNA表達上調幅度最大，分別上調至對照組的6.31倍、6.44倍和15.4倍。其中，PPARγ顯著上調，由于PPARα和PPARβ誤差較大，與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖1 未分化hBMSCs暴露于全氟辛烷磺酸(PFOS) 7 d后的細胞存活率Fig. 1 Cell viability of un-induced hBMSCs after 7 d of perfluorooctane sulfonate (PFOS) exposure

圖2 PFOS暴露7 d對未分化hBMSCs中PPARα、PPARβ和PPARγ mRNA表達水平的影響注：與對照組相比，*P<0.05。Fig. 2 Effects of PFOS on mRNA expressions of PPARα, PPARβ, and PPARγ after 7 d of exposure in un-induced hBMSCsNote: Compared with the control, *P<0.05.

2.2 PFOS對hBMSCs分化關鍵調控基因mRNA表達水平的影響

ALP和Runx2均為成骨分化早期的標志性基因，經PFOS暴露7 d后，細胞ALP和Runx2的mRNA表達水平下降(圖3)。PFOS在1 μmol·L-1濃度下產生的抑制作用最強，ALP和Runx2的mRNA表達水平分別下調至對照組的50.2%和67.4%，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 PFOS暴露7 d對未分化hBMSCs中ALP、RUNX2和OPG mRNA表達水平的影響注：與對照組相比，**P<0.01。Fig. 3 Effects of PFOS on mRNA expressions of ALP, RUNX2, and OPG after 7 d of exposure in un-induced hBMSCsNote: Compared with the control, **P<0.01.

與ALP和Runx2相反，PFOS暴露使OPG的mRNA表達水平升高。在0.1 μmol·L-1PFOS作用下，OPG表達水平升高至對照組的2.62倍，且差異顯著(P<0.05)。

2.3 PFOS對hBMSCs成骨/成脂分化表型標志物的影響

進一步研究PFOS暴露對hBMSCs成骨/成脂分化的影響。陽性對照成骨誘導因子BMP2對鈣沉積產生促進作用，但差異不顯著。成脂誘導因子ROSI對脂肪滴形成產生顯著的促進作用(圖4和圖5)。PFOS抑制鈣沉積，0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1的PFOS表現出顯著性抑制作用(圖5)。同時，PFOS呈劑量依賴性促進脂質形成，在1 μmol·L-1和10 μmol·L-1濃度下，細胞脂質形成顯著升高，分別升高至對照組2.1倍和2.7倍。

圖4 成骨/成脂雙向分化第14天用茜素染色測定鈣沉積和用油紅O染色測定脂肪滴注：(a)～(c)為鈣結節染色，依次為溶劑對照、10 μmol·L-1 PFOS處理組和陽性對照BMP2處理組；(d)～(f)為脂肪滴染色，依次為溶劑對照、10 μmol·L-1 PFOS和陽性對照ROSI處理組。Fig. 4 Calcium deposition measured by Alizarin Red S staining and fat droplets measured by Oil Red O staining on day 14th of osteogenic/adipogenic bidirectional differentiationNote: (a)～(c) show nodule staining of solvent control, 10 μmol·L-1 PFOS treatment group and positive control BMP2 treatment group; (d)～(f) show fat drop staining of solvent control, 10 μmol·L-1 PFOS and positive control ROSI treatment group.

圖5 誘導分化條件下PFOS暴露14 d對hBMSCs中鈣結節形成和脂肪滴形成的影響注：與對照組相比，*P<0.05。Fig. 5 Effects of 14 d of exposure to PFOS on calcium nodule formation or droplet formation in hBMSCs cultured in induction mediumNote: Compared with the control, *P<0.05.

2.4 PFOS對hBMSCs基因表達譜的影響

在未分化條件下經0.1 μmol·L-1PFOS暴露7 d后，hBMSCs的基因表達譜中篩選出597個差異表達基因(P<0.05且log2(表達差異倍數)>0.3)。通過GSEA對差異基因進行通路富集分析，在表1中列出了根據P值選取受影響最顯著的10個通路。其中，細胞凋亡(P=0.028)與骨質疏松癥之間聯系緊密，成骨細胞和破骨細胞凋亡可能與骨質疏松直接相關[18]。剪接體(P=0.106)通路相關基因異常突變可導致E/A剪接復合體功能受損，是骨髓增生異常的發病的主要機理[19]。

表1 PFOS誘導hBMSCs差異表達基因富集的生物學通路Table 1 Biological pathways enriched by the differentially expressed genes affected by PFOS in hBMSCs

3 討論(Discussion)

盡管PPARs是PFOS的首要分子靶標，PPARs相關的PFOS毒性作用通路仍不清楚。筆者比較研究了PFOS對PPARs各亞型的干擾及其與細胞分化之間的關聯，對深入理解PFOS的毒性作用機理具有重要意義。PFOS暴露誘導hBMSCs細胞PPARα、PPARβ和PPARγ表達均上調，與以往研究結果一致。動物毒理學研究表明，PFOS激活PPARα信號通路，并可誘發小鼠和大鼠肝癌[20]。Li等[21]發現，PFOS激活3T3-LI細胞中PPARs信號傳導促進脂肪形成，其中PPARγ起主要作用，PPARα和PPARβ作用相對較弱，通過分子對接模擬顯示PFOS直接與PPARα、PPARβ和PPARγ結合。筆者前期研究發現，hBMSCs在成脂誘導分化條件下，經0.2～100 nmol·L-1PFOS暴露7 d后，PPARγ的mRNA表達水平升高至對照組的1.05倍～1.53倍[15]，上調倍數低于本研究，主要原因可能為未誘導分化條件下，無其他成脂誘導因子共同作用，PFOS對hBMSCs中PPARγ的激活作用更明顯。

因為PPARs在細胞分化調控中起重要作用，因此進一步測定了PFOS暴露對細胞分化關鍵基因mRNA表達的干擾。Runx2表達下調與PPARγ激活一致。PPARγ和Runx2均是調節hBMSCs細胞分化的關鍵轉錄因子，在細胞分化過程中二者轉錄活性的調控機制密切關聯，但變化趨勢相反。p38MAPK介導絲氨酸磷酸化導致PPARγ失活和RUNX2激活，而蛋白磷酸化酶5通過PPARγ和Runx2蛋白的去磷酸化，激活PPARγ抑制RUNX2[7]。而OPG上調與PPARβ激活一致，主要原因可能為PPARβ的激活誘導成骨細胞中WNT-β-catenin介導的OPGmRNA表達增加[8]。OPG為骨轉換關鍵因子，成骨細胞中OPG與RANK結合，形成調節骨代謝的OPG/RANKL/RANK通路有效抑制破骨細胞的發育，并增加骨量[22]。因此，PPARs各亞型的激活可能在調控細胞分化中產生不同的作用。

細胞分化表型標志物的分析結果表明，在雙向分化條件下，PFOS暴露抑制成骨分化且促進成脂分化，與ALP和RUNX2基因表達下調一致，主要原因可能為PPARγ激活。PPARγ是成脂分化的關鍵正向調控因子，也是成脂/成骨分化平衡的關鍵因子。在骨髓中，PPARγ激活抑制Runx2介導的骨鈣素在成骨細胞中的轉錄[22]。筆者經前期研究發現，在分別對hBMSCs進行定向成骨分化誘導和成脂分化誘導時，PFOS抑制成骨分化，促進成脂分化[15]。本研究發現，在成脂/成骨雙向誘導分化模型中，PFOS干擾骨髓干細胞成骨/成脂分化平衡，進一步證明hBMSCs多向分化是PFOS暴露的敏感靶標，對于揭示其毒性作用機制具有重要價值。PFOS作用下hBMSCs基因表達譜中差異表達基因的富集分析顯示，受影響通路主要涉及細胞分化、骨代謝和脂質代謝相關通路，進一步證實了PFOS對hBMSCs分化潛能的損傷，并提示骨代謝和脂代謝相關生物學過程受到干擾。PFOS激活PPARβ可能是OPG表達上調的重要機制[8]，其在PFOS干擾細胞分化中的作用，仍需進一步研究。盡管OPG表達上調，但細胞成骨分化仍受到抑制，可能是因為PFOS對PPARγ的激活作用強于PPARβ。此外，PFOS暴露劑量和暴露時間也是影響細胞分化效應的重要因素。研究結果提示有必要進一步研究PFOS以及其他PFASs類化學物對PPARs各亞型的激活與hBMSCs分化紊態失衡之間的關聯，有利于闡明PFASs損傷干細胞分化的毒性機理，并為該類化學品健康效應的預測和篩選提供理論依據和方法。

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