天津市中心城區集中供應管網末梢水的抗生素耐藥基因污染特征研究

梁永兵，李海北，程春燕，師丹陽，陳鄭珊，楊棟，孫棟良，邵一帆，李君文，金敏

軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津 300050

抗生素在治療人類傳染病方面做出了巨大貢獻，同時也在農業和畜牧業中應用廣泛[1-2]，但隨之而來的抗生素耐藥性問題也越來越嚴重。世界衛生組織公布了2019年全球健康面臨的最大威脅清單，細菌抗生素耐藥問題位列第五，而抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作為細菌產生抗生素耐藥性的重要遺傳基礎，已被定義為一種新型環境污染物并對人類健康產生嚴重威脅[3]。尤其近幾年來，隨著耐萬古霉素腸球菌等超級耐藥細菌(super antibiotic resistance bacteria, SARB)不斷涌現，其超級耐藥基因(super antibiotic resistance genes, SARGs)如blaNDM-1和mcr-1在水中的污染也不容小覷。Khan等[4]在印度和巴基斯坦管網末梢水細菌中發現耐碳青霉烯類基因blaNDM-1，而在中國和美國等水樣中檢測出耐多粘菌素類基因mcr-1，且該基因能夠通過飲用水污染途徑定植到小鼠腸道菌群；曹振華等[5]也在南京地區自來水廠出水細菌中檢出mcr-1和blaNDM-1。

自然環境中的SARGs主要有細胞內SARGs(intracellular SARGs, iSARGs)與細胞外SARGs(extracellular SARGs, eSARGs)2種存在形式。其中，iSARGs位于細菌內部，可通過基因垂直傳播或接合轉移、轉導等水平轉移方式傳播抗生素耐藥性，而eSARGs獨立存在于環境中，是由菌體分泌或者死亡裂解后釋放到外部環境中的游離DNA，具有水平轉移及轉化的風險[6]，如Jin等[7]發現，消毒過程中死亡的細菌釋放的游離ARGs可轉化消毒損傷細菌，從而促進細菌間ARGs的傳播與擴散。因此，不管iSARGs還是eSARG，均對水中SARB的傳播與擴散具有重要作用，而生活飲用水中iSARGs和eSARG污染，均可能對人類健康造成風險。2019年，我們首次報告管網末梢水除了存在sul1和sul2等胞內ARGs(intracellular ARGs, iARGs)外，還有相關胞外ARGs(extracellular ARGs, eARGs)污染[8]，然而，截止目前，還未見管網末梢水中有關eSARGs的污染特征研究。

基于此，本文以天津市中心城區的集中供應管網末梢水為研究對象，通過分析包括blaNDM-1、mcr-1、blaKPC和vanA等SARGs在內的15種ARGs的污染現狀，闡明天津市集中供應管網末梢水的ARGs污染特征。本研究將為今后生活飲用水ARGs的風險評估及其控制奠定基礎，也為今后能將ARGs監測措施和風險管理策略納入公共衛生決策系統提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器與試劑

DN-ZY正壓過濾器(海寧市能大過濾設備有限公司)，BT100-2J蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)，2-16KL臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，ViiA 7Dx熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，2100P便攜式濁度分析儀(美國Hach公司)，HQ40d便攜式測定儀(美國Hach公司)，DR1900便攜式分光光度計(美國Hach公司)，HH.Bll-500BS型恒溫培養箱(天津市天宇實驗儀器有限公司)；水相微孔過濾膜(北京市北化黎明膜分離技術有限責任公司)，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(瑞士Roche公司)，Fast DNA Spin Kit for Soil(美國MP Bio公司)，DNA純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；營養瓊脂培養基、m-Endo培養基、MFC培養基和MUG瓊脂培養基等購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 水樣采集

根據天津中心城區的6個行政區域分布，從各區域中隨機選取一個采樣點進行管網末梢水樣采集(圖1)，水樣采集體積為20 L，采樣時間為2020年5月，每個采樣點采集3次。水樣采集后，冷藏條件下迅速運回實驗室開展實驗。

圖1 天津市中心城區采樣點分布圖注：采樣時間及地點如下，采樣點① 2020年5月6、13和20日8:00—10:00，天津市和平區大理道；采樣點② 2020年5月6、13和20日10:00—12:00，天津市河西區樂園道；采樣點③ 2020年5月6、13和20日14:00—16:00，天津市河東區成林道；采樣點④ 2020年5月8、15和22日8:00—10:00，天津市河北區黃緯路；采樣點⑤ 2020年5月8、15和22日10:00—12:00，天津市紅橋區芥園道；采樣點⑥ 2020年5月8、15和22日14:00—16:00，天津市南開區水上公園東路。Fig. 1 Sampling sites of Tianjin city centerNote: Sampling time and location were as follows: Sampling site ① 8:00—10:00 on May 6th, 13th and 20th, 2020, Dali Road, Heping District, Tianjin; Sampling site ② 10:00—12:00 on May 6th, 13th and 20th, 2020, Leyuan Road, Hexi District, Tianjin; Sampling site ③ 14:00—16:00 on May 6th, 13th and 20th, 2020, Chenglin Road, Hedong District, Tianjin; Sampling site ④ 8:00—10:00 on May 8th, 15th and 22nd, 2020, Huangwei Road, Hebei District, Tianjin; Sampling site ⑤ 10:00—12:00 on May 8th, 15th and 22nd, 2020, Jieyuan Road, Hongqiao District, Tianjin; Sampling site ⑥ 14:00—16:00 on May 8th, 15th and 22nd, 2020, Water Park East Road, Nankai District, Tianjin.

1.3 水質理化及微生物指標的檢測

參照《生活飲用水標準》(GB/T 5749—2006)[9]和《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)[10]對自來水的理化及微生物指標進行檢測。濁度采用便攜式濁度分析儀測定；pH值和電導率由HQ40d便攜式測定儀測定；余氯和氨氮采用DR1900便攜式分光光度計測定；高錳酸鉀指數利用DRB200型數字反應器(美國Hach公司)和DR1900便攜式分光光度計檢測。菌落總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌分別利用營養瓊脂、m-Endo培養基、MFC培養基和MUG瓊脂培養基進行細菌培養和計數。每組做3個平行實驗。

1.4 細菌的富集及iARGs的提取

細菌的富集及iARGs的提取方法參照文獻[11]，在正壓過濾器中裝入孔徑0.22 μm的濾膜，利用蠕動泵將20 L水勻速(50 mL·min-1)通過過濾器后，將濾膜取出剪碎，并用100 mL的3%牛肉膏洗脫液浸泡，置于磁力攪拌器中攪拌30 min(4 ℃)后，將細菌懸液收集到50 mL的離心管中；離心(8 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，棄上清；向沉淀中加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)緩沖液重懸，用Fast DNA Spin Kit for Soil提取DNA后，置于-80 ℃保存待測。

1.5 eARGs的富集與純化

參照文獻[6]的方法，制備核酸吸附顆粒并利用核酸吸附-洗脫方法收集胞外游離核酸。以PBR322質粒作為內參(終濃度為20 GC·mL-1)，加入到上述過濾后的管網末梢水中，以50 mL·min-1流速通過裝有80～90 g核酸吸附顆粒的過濾柱(直徑5 cm、高30 cm)，用300 mL洗脫液(15 g·L-1氯化鈉、30 g·L-1胰蛋白胨、15g·L-1牛肉粉、3.75 g·L-1甘氨酸、0.28 g·L-1氫氧化鈉，pH=9.3±0.2)進行洗脫。將收集的洗脫液通過PES微孔膜過濾器(φ 0.22 μm，美國Milipore公司)后，加入同等體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置16 h；離心(10 000 r·min-1，4 ℃)10 min后，棄上清；用體積分數為70%的乙醇水溶液重懸沉淀并離心(10 000 r·min-1，5 min，4 ℃)；棄上清后靜置數分鐘，使乙醇充分揮發；加入1 mL無菌Tris-EDTA緩沖液(pH=8.0)混勻。利用用DNA純化試劑盒進一步純化胞外核酸后，置于-80 ℃保存待測。

1.6 ARGs的定量檢測

利用熒光定量PCR技術(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)檢測15種具有代表性的不同類別ARGs(表1)，其qPCR反應體系、反應條件及標準曲線的建立參見文獻[11]。引物和ARGs標準品由上海生工有限公司合成，每個基因做3次平行檢測并設有陰性對照(DEPC水代替樣品模板)和陽性對照(相應ARGs標準品代替樣品模板)。

表1 本研究所用引物[11-15]Table 1 The primers used in this study[11-15]

1.7 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行數據統計學分析。其中，數據滿足正態性要求的用Paired-Samplet-test檢驗，數據不滿足正態性要求的用Wilcoxon檢驗，比較多個獨立樣本的分布差異用Kruskal-Wallis H檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 集中供應管網末梢水的水質指標情況

所有待檢管網末梢水樣的水質指標均符合我國生活飲用水衛生標準(GB/T 5750.12—2006)，其中濁度0.1～0.8 NTU、pH 7.8～8.4、余氯0.3～0.7 mg·L-1、電導率278～385 μs·cm-1、氨氮0.35～0.45 mg·L-1、高錳酸鹽指數0.50～2.85 mg·L-1、菌落總數均≤1 CFU·mL-1，總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌均未檢出。

2.2 集中供應管網末梢水的ARGs檢出頻率

在待檢的15種ARGs中，除blaKPC未被發現外，其余ARGs均在管網末梢水中檢出(表2)。其中，iARGs共檢測出13種，且mcr-1、vanA、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA、dfrA1和katG等10種ARGs在所有水樣中均被檢出，而rpoB1、ermB和catA1只在部分水樣中檢出，qnrA和blaKPC一直未檢出。對于eARGs，共檢測出12種，其中，mcr-1、vanA、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA和dfrA1等8種的檢出率為100%，ermB、katG和blaKPC一直未檢出，而qnrA、blaNDM-1、rpoB1和catA1等4種ARGs僅在部分水樣中檢測出。因此，天津市管網末梢水殘留細菌的體內外均存在mcr-1、vanA、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA、dfrA1、rpoB1和catA1等11種ARGs污染，其中vanA、mcr-1和blaNDM-1等SARGs尤為值得注意，它們以iARGs和eARGs這2種形態存在于所有水樣，另外，ermB和katG僅出現在iARGs中，而qnrA僅出現在eARGs中。

2.3 天津中心城區集中供應管網末梢水的ARGs污染特征

天津市中心城區集中供應管網末梢水的ARGs濃度水平如圖2所示，其中，iARGs的相對濃度是水中iARGs的絕對濃度與16S rDNA絕對濃度的比值。由圖2可知，aadA、blaTEM和sul1是天津市管網末梢水的主要ARGs，而在SARGs陽性水樣中，vanA和mcr-1濃度較高。對于iARGs，aadA相對濃度和絕對濃度均最高(圖2(a)～2(b))，平均值分別為0.16 GC·L-1和2.6 ×104GC·L-1；其次為blaTEM和sul1，絕對濃度平均值分別為2.4×104GC·L-1和1.8×104GC·L-1。對于eARGs，aadA絕對濃度同樣最高(圖2(c))，平均值為7.4×103GC·L-1，其次為blaTEM(平均值6.5×103GC·L-1)以及sul1(平均值4.2×103GC·L-1)。同時，tetM、tetA、dfrA1、vanA和mcr-1也是天津市管網末梢水中含量較高的基因，各基因的胞內濃度平均值為1.9×103～6.9×103GC·L-1，而胞外濃度平均值為2.7×102～1.8×103GC·L-1，以上8種基因總濃度分別占iARGs和eARGs的97.25%和99.18%。

通過對比分析，天津市管網末梢水的iARGs總絕對濃度為eARGs的3.8倍(圖2(d))。同時，還發現除了qnrA只在eARGs中被檢出外，同一種ARGs的胞內絕對濃度均高于胞外(P<0.05)。如blaNDM-1的胞內絕對濃度平均值為1.2×103GC·L-1，而胞外含量極低，平均值僅為2.0 GC·L-1；mcr-1的胞內絕對濃度平均值為4.2×103GC·L-1，而胞外濃度僅為266 GC·L-1。

圖2 天津市中心城區集中供應管網末梢水的ARGs濃度(n=18)Fig. 2 The concentration of ARGs in the terminal tap water in city center of Tianjin (n=18)

2.4 天津中心城區不同區域集中供應管網末梢水的ARGs污染特征

如圖3所示，各區水中iARGs總絕對濃度為5.8×104～1.1×105GC·L-1，且各區之間無統計學差異(P>0.05)(圖3(a))，但其相對濃度卻有統計學差異(P<0.05)(圖3(b))，其中，河西區iARGs相對濃度最高，達到0.99；紅橋區最低，河西區為紅橋區8倍。同時，不同區域水中檢測出的ARGs種類不同。其中，vanA、mcr-1、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA和dfrA1等在各區水樣均能檢出，rpoB1僅在河東區、河北區和紅橋區檢出；ermB僅在河北區檢出；catA1僅在河西區檢出。

對于eARGs，各區總絕對濃度為9.9×103～3.6×104GC·L-1，且各區之間無統計學差異(P>0.05)(圖3(c))，但不同區域的ARGs種類不盡相同。aadA、blaTEM、sul1、tetM、mcr-1、vanA、tetA和dfrA1等在各區水樣均能檢出，而qnrA在和平區、河西區和河東區檢出；blaNDM-1在和平區、河西區和河北區檢出；rpoB1在和平區、河西區和河東區檢出；catA1僅在河東區檢出。

圖3 天津市中心城區不同區域集中供應管網末梢水的ARGs濃度(n=3)Fig. 3 The concentration of ARGs in the terminal tap water in various districts of city center of Tianjin (n=3)

3 討論(Discussion)

管網末梢水存在iARGs的污染，其原因可能有以下幾點。(1)水源水本身普遍存在ARGs污染。天津城市供水主要靠引江水和灤水[16]。Zhang等[17]對15種抗生素及5種ARGs進行檢測，在長江采集的所有水樣中均檢出。王若楠等[18]從長江水分離出mcr-1攜帶菌，且其耐多粘菌素的半抑制濃度較高。水源水ARGs污染會增加其在管網末梢造成污染的風險[19]。(2)自來水存在的抗生素污染促進了細菌產生抗生素耐藥性。張新波等[20]對天津市供水系統抗生素分布特征進行研究，發現無論是自來水廠出水還是管網末梢水，都普遍存在6類10種抗生素的污染。(3)自來水廠處理工藝會導致ARGs富集。天津市自來水廠主要采用氯化消毒，而越來越多的研究表明，氯化消毒在一定條件下加劇ARGs污染，如Shi等[21]發現氯化消毒后，水中β-內酰胺類和四環素類等ARGs相對濃度上升，Jin等[7]報道，氯化消毒可以通過促進質粒自然轉化而加強ARGs跨細菌種屬傳播。(4)細菌消毒劑抗性/抗生素耐藥性的共選擇作用。侯愛明等[22-23]從氯消毒飲用水系統中收集了150株耐氯存活細菌，發現80%氯損傷非苛養細菌對抗生素具有多重耐藥性，其機制可能與細胞膜藥物外排泵表達升高有關。(5)供水管網生物膜對ARGs的富集。生物膜細菌通常會分泌大量聚合物，使管網末梢水中的微生物富集，形成三維網狀結構，在共同抵御不良外界環境的同時更加大了ARGs水平轉移的風險[24]。(6)管網新舊、采樣點與水廠距離等原因也會導致不同區域管網末梢水ARGs污染程度不同[25-26]。

同時，在本研究中，我們發現管網末梢水普遍存在eARGs污染。eARGs是耐藥菌活體分泌或死后釋放的一種污染物，它們可通過自然轉化和轉導的方式傳遞抗生素耐藥性，且不需要活體供體細胞[27]。同時，消除這些eARGs比殺死抗生素耐藥菌困難得多[28]。如Roller等[29]報道，即使被二氧化氯滅活了流感嗜血桿菌(滅活率為6個對數)，細胞內DNA仍是完整的膠狀。Jin等[7]發現，盡管耐藥菌在氯化作用后已經有效死亡，但它們釋放的eARGs仍保留生物學活性并可通過轉化進入其他細菌，而且，只有在超高劑量消毒劑使用情況下才能使之完全降解。鑒于eARGs易傳播和難降解的特點，管網末梢水中的eARGs污染不容忽視。

值得關注的是，本研究還發現管網末梢水中存在iARGs和eARGs這2種形態的vanA、mcr-1和blaNDM-1等SARGs。vanA是耐萬古霉素的ARGs，同時還可使細菌對環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素和替考拉寧耐藥性[30]，這是較早發現的多重耐藥SARGs。mcr-1和blaNDM-1是近年來發現的新型ARGs，前者具有被稱為抵御細菌耐藥性“最后一道防線”的多黏菌素類抗生素的耐藥能力，后者可使細菌表達β-內酰胺類抗生素水解酶，對除多黏菌素外的所有抗生素均有耐藥性[5]，故攜帶mcr-1和blaNDM-1的耐藥菌往往無藥可治。研究表明，SARGs能夠通過飲用水污染途徑定植到小鼠腸道菌群[4]，再加上SARGs兼具易傳播、難降解和多重耐藥的特點，水中SARGs污染將對人類健康產生潛在威脅，因此，管網末梢水中SARGs帶來的健康風險及公共衛生危害應當引起我們的關注與重視，這也對提高國家飲用水標準、改進自來水廠處理工藝帶來了挑戰。

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