重組人金屬硫蛋白-Ⅲα短肽毒性效應的初步研究

甘俊英，秦建新，原海亮，李強，薛玉英,*

1. 環境醫學工程教育部重點實驗室，東南大學公共衛生學院，蘇州納米科技協同創新中心，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210009 2. 蘇州匯涵醫用科技發展有限公司，常熟 215500 3. 常熟市市場監督管理局，常熟 215500

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類富含半胱氨酸、相對分子質量較低(6～7 kDa)的金屬結合蛋白[1]，包含2個獨立結構域，即α結構域和β結構域。MT由Margoshes和Vallee于1957年首次從馬的腎臟中分離出來，至今對MT的研究已走過半個多世紀，大多數研究集中在脊椎動物MT的結構、功能和基因調節等方面，研究成果豐富，涉及生物化學、衛生毒理學、食品科學、醫學、農學和環境科學等各個領域[2]。由于MT特有的氨基酸組成與分子結構，其在機體內具有多種生物功能。首先，MT的特殊結構使得它具有和多種金屬離子結合的能力，包括鎘、鋅、鉛和鐵等[3-4]，MT可通過與金屬離子的結合，降低重金屬對機體的毒害，達到調節機體生理狀態的作用[5]。有研究表明，MT還具有清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的功能[6-8]，但其作用機理仍不清楚，一般認為其可以清除體內過多的自由基，從而降低氧化損傷程度[9]。癌癥仍是當今醫學界的一個瓶頸，據《2018年全球癌癥統計數據》報道，2018年全球大約有1 810萬癌癥新發病例和960萬癌癥死亡病例，新增1 810萬癌癥病例中，亞洲占據近1/2，960萬癌癥死亡患者中，亞洲占近70%[10]；已有多項研究探索了MT在多種惡性腫瘤中的表達，通過多種作用機制發揮促癌及抑癌的雙重功能[11]。鑒于MT的多種生物功能，未來外源性補充MT具有廣闊的應用前景，尤其是MT結合金屬作用，其在植物中的表達可提高植物抗脅迫能力[12]，已被應用到環境重金屬污染的治理當中。

MT主要有4種異構體，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多數哺乳動物的內臟器官中廣泛存在，尤以肝、腎細胞為主，而且參加其功能調節。MT-Ⅲ分布主要限于中樞神經系統，主要分布于星形膠質細胞和神經元中，還有少量分布于生殖細胞、小腸、胃、腎和嗅覺皮質細胞中。MT-Ⅳ存在于皮膚和胃腸道上部。目前，MT的獲取途徑分為3類，一是從動物組織中提取[13]，二是從植物中提取[14]，三是采用基因工程技術，將MT基因克隆至大腸桿菌或乳酸菌等宿主中進行發酵提純[15]，相對于前2種方法，第3種方法獲取的MT純度高，產品單一性好，性能更加穩定，特別是對人源MT蛋白的異源表達，使得人源蛋白產品的應用及產業化成為可能，同時人源蛋白機體同源性好，可以避免一些免疫原反應，在醫藥領域應用前景廣闊。王欣卉等[16]利用體外抗氧化試驗驗證了酵母源金屬硫蛋白具有清除自由基及抑制脂質過氧化的功能，表現出良好的抗氧化性。由于其抗氧化功能及低分子量的特性[17]，MT將成為化妝品領域最佳的生物添加劑，與目前化妝品中常用的抗氧化添加劑(超氧化物歧化酶(SOD))相比，MT分子量低，更易被皮膚吸收。顧群和杜欣[18]將鋅合MT加入到面霜中，利用家兔及豚鼠模型，從整體動物水平評價了鋅合MT的皮膚毒性，而在細胞水平上對其皮膚毒性的探討尚鮮見報道。

本研究針對大腸桿菌基因工程制備的重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(rh-MT-Ⅲα)，以人永生化角質形成細胞HaCaT細胞和小鼠成纖維細胞L929細胞為模型，從細胞水平上評價其可能的毒性效應，進而利用秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)為模型，進行了整體模型毒性評價，為rh-MT-Ⅲα的安全應用提供實驗基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑儀器與細胞來源

1.1.1 材料與試劑

試驗樣品：重組人MT-Ⅲα短肽，商品名為重組人巰基短肽(rh-MT-Ⅲα)，由蘇州匯涵醫用科技發展有限公司提供，是該公司利用大腸桿菌基因工程高密度發酵并純化獲得的人源金屬硫蛋白Ⅲα亞基片段，分子量3.7 kD，每分子蛋白含游離巰基6個，蛋白SDS-PAGE純度≥98%。

主要試劑：DMEM高糖培養液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(博士德生物工程有限公司)，噻唑藍(MTT)(美國Sigma公司)，LDH試劑盒(碧云天生物公司)，細胞凋亡試劑盒(美國BD公司)。磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸鎂、蛋白胨、瓊脂、磷酸鉀、氯化鈣、膽固醇、酵母提取物、胰蛋白胨、氫氧化鈉、鹽酸和次氯酸鈉等(南京晚晴化玻儀器有限公司)。

1.1.2 主要儀器

3423型CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；Biobase生物安全柜(中國博科控股集團有限公司)、FSX型圖像導航儀(日本Olympus公司)、5424R型離心機(德國Eppendorf公司)；Epoch型酶標儀(美國Bio Tek公司)；MVS-1型渦旋混合器(中國北京金紫光科技發展有限公司)；BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；MilliQ Advantage型超純水系統(美國密理博公司)；Olympus SZ61體視顯微鏡(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；SW-CJ-2F超凈工作臺(中國蘇州凈化設備有限公司)；SHP150生化培養箱(中國上海精宏試驗設備有限公司)

1.1.3 實驗細胞及動物

HaCaT細胞是非腫瘤來源的人正常皮膚永生化角質形成細胞株，與正常人角質形成細胞分化特性相似，可以繁殖150代以上。本試驗用HaCaT細胞購自上海名勁生物科技有限公司。

L929細胞是非腫瘤來源的小鼠成纖維細胞，購自上海名勁生物科技有限公司。

野生型秀麗隱桿線蟲株(N2)取自美國明尼蘇達大學線蟲遺傳中心(CaenorhabditisGenetic Center，CGC)，雌雄同體。

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒溶液的配制

細胞試驗：染毒液劑量依據現有研究試驗劑量擴大10倍。使用完全培養基，將rh-MT-Ⅲα配制成濃度為2 mg·mL-1的原溶液，渦旋1 min混勻，染毒時利用完全培養基將原液稀釋成濃度為25～400 μg·mL-1的rh-MT-Ⅲα溶液。線蟲實驗：使用超純水，將rh-MT-Ⅲα配制成濃度為1 mg·mL-1的原溶液，渦旋1 min混勻，染毒時利用純水將原液稀釋成濃度為5、50和500 μg·mL-1的rh-MT-Ⅲα溶液。染毒液均現配現用。

1.2.2 劑量與染毒

(1)噻唑藍(MTT)細胞活性試驗：HaCaT細胞和L929細胞使用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)于37 ℃、5% CO2常規傳代培養。觀察細胞狀態良好，調整細胞懸浮液密度為1×105個·mL-1，分別接種于96孔板(每孔0.2 mL)和6孔板(每孔2 mL)中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。培養結束后，吸出原培養液，加入染毒液，劑量為25、50、100、200和400 μg·mL-1，完全培養基作為空白對照，繼續培養24 h后，吸出染毒液，加入MTT，4 h后緩慢吸出MTT，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床10 min后，用酶標儀在490 nm處測OD值，計算細胞存活率。

(2)乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗：細胞培養同上，種板濃度為1×104個·mL-1。操作按照試劑盒步驟進行。LDH為胞內酶，一般在細胞外不能被檢測到，只有在細胞膜損傷時，可釋放到胞外而被檢測到，是評判細胞膜完整性的一個重要指標。

(3)細胞形態學觀察：種板濃度同MTT，種板6孔板，每孔2 mL。染毒劑量選擇400 μg·mL-1，染毒時間為24 h。

(4)細胞凋亡：種板濃度及染毒劑量同MTT，種板6孔板，每孔2 mL。染毒24 h后，按照凋亡試劑盒步驟檢測細胞凋亡指標。

(5)線蟲試驗：以劑量為5、50和500 μg·mL-1的rh-MT-Ⅲα溶液進行染毒，以同體積純水為空白對照，以200 μL體積加入含菌OP50的3 cm培養基均勻覆蓋，待其自然晾干后將同步化后L1期線蟲轉移至培養基上。染毒48 h后進行線蟲運動行為(頭部擺動和身體彎曲)、線蟲生長發育(體長)和咽泵頻率評價。

1.2.3 數據處理

采用SPSS Statistics 22.0軟件進行數據分析，多組之間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。兩組之間比較，若符合方差齊性，則采用LSD-t檢驗方法，若方差不齊，則采用Games-Howell檢驗方法。實驗數據均以mean±SD表示，檢測水平為P<0.05，差異有統計學意義。線蟲體長測量應用image J軟件處理。

2 結果(Results)

2.1 細胞存活率及細胞膜損傷結果

rh-MT-Ⅲα對HaCaT細胞和L929細胞的存活率影響結果如圖1所示，在實驗劑量下，與空白對照組相比，實驗組細胞存活率無明顯改變，與對照組基本持平，400 μg·mL-1劑量下，細胞存活率出現了降低，但這些改變均未達到統計學上的顯著性。L929細胞存活率總體趨勢與HaCaT細胞相同，均為隨劑量升高而呈現先升高后降低趨勢。

圖1 重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(rh-MT-Ⅲα)對HaCaT細胞和L929細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of recombinant human metallothionein Ⅲ-α peptide (rh-MT-Ⅲα) on survival rate of HaCaT and L929 cells

LDH檢測結果如圖2所示，與對照組比較，2種細胞的LDH釋放率在400 μg·mL-1時顯著升高，25～200 μg·mL-1劑量下，LDH釋放率與對照組無明顯差異。HaCaT細胞LDH釋放率呈現先降低，后增高的趨勢，L929細胞的趨勢不明顯。

圖2 rh-MT-Ⅲα對HaCaT細胞和L929細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率的影響注：與對照組相比，* P<0.05，差異具有統計學意義；數據表示為均值±標準差。Fig. 2 Effect of rh-MT-Ⅲα on lactate dehydrogenase (LDH) release of HaCaT and L929 cellsNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; data are expressed as mean±standard deviation.

2.2 細胞形態學觀察結果

根據LDH實驗結果，400 μg·mL-1時，細胞膜可能開始出現損傷，故選此劑量觀察細胞形態學變化。2種細胞經rh-MT-Ⅲα染毒24 h后，光學顯微鏡觀察結果如圖3所示，在400 μg·mL-1劑量下，實驗組細胞與對照組細胞連接均緊密，HaCaT細胞呈鋪路石狀，L929細胞呈梭形，2種細胞染毒組與對照組未出現明顯差別。

圖3 rh-MT-Ⅲα對HaCaT細胞和L929細胞形態的影響注：(a) 陰性對照組(完全培養基)；(b) 400 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα溶液組；標尺為20 μm。Fig. 3 Effect of rh-MT-Ⅲα on morphology of HaCaT and L929 cellsNote: (a) Negative control group, complete medium; (b) 400 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα solution; scale is 20 μm.

2.3 細胞凋亡結果

2種細胞經rh-MT-Ⅲα染毒24 h后，細胞存活率及形態學觀察與對照組相比均未顯示出明顯差異，但LDH釋放量在400 μg·mL-1劑量下，明顯升高，基于前期實驗結果，推測可能由于rh-MT-Ⅲα對2種細胞的凋亡(尤其早期凋亡)產生了影響，故考察了rh-MT-Ⅲα對2種細胞凋亡率的影響，結果如圖4所示，與對照組相比，2種細胞凋亡率均在400 μg·mL-1劑量下明顯上升，尤其是早期凋亡率，為對照組的4倍～5倍。

圖4 rh-MT-Ⅲα對HaCaT細胞和L929細胞凋亡的影響注：與對照組相比，* P<0.05，差異具有統計學意義；數據表示為均值±標準差。Fig. 4 Effect of rh-MT-Ⅲα onapoptosis of HaCaT and L929 cellsNote: Compared with the negative control group, * indicates significant differences at P<0.05 level; data are expressed as mean±standard deviation.

2.4 rh-MT-Ⅲα對線蟲運動行為的影響

經rh-MT-Ⅲα染毒48 h后，檢測線蟲運動行為包括頭部擺動和身體彎曲頻率，結果如圖5所示，染毒液以5、50和500 μg·mL-1劑量均勻覆蓋含大腸桿菌的NGM線蟲培養基后自然風干，加入L1期線蟲延長暴露48 h，與對照組相比，實驗組中頭部擺動頻率(20 s)及身體彎曲頻率(60 s)無明顯差異。

圖5 rh-MT-Ⅲα對線蟲運動行為的影響Fig. 5 Effect of rh-MT-Ⅲα on movement of C. elegans

2.5 rh-MT-Ⅲα對線蟲體長的影響

L1期線蟲延長染毒48 h后，用M9溶液清洗3遍，取出線蟲，以100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液麻醉線蟲1 min后用移液槍吸取適量線蟲于載玻片上，于顯微鏡下觀察每組線蟲并捕捉圖像，獲取圖像經由軟件Image J處理測量，結果如圖6所示，高劑量組(500 μg·mL-1)線蟲平均體長為965.53 μm，中劑量組(50 μg·mL-1)線蟲平均體長為996.80 μm，低劑量組(5 μg·mL-1)線蟲平均體長為972.53 μm，與對照組平均體長((968.35±93.82) μm)相比，染毒組線蟲體長未出現明顯差異。

圖6 rh-MT-Ⅲα對線蟲體長的影響Fig. 6 Effect of rh-MT-Ⅲα on length of C. elegans

2.6 rh-MT-Ⅲα對線蟲攝食行為的影響

不同濃度rh-MT-Ⅲα對線蟲攝食行為的影響如圖7所示，與對照組相比，染毒組線蟲咽泵頻率的變化無統計學意義。

圖7 rh-MT-Ⅲα對線蟲咽泵頻率的影響Fig. 7 Effect of rh-MT-Ⅲα on pumping rate of C. elegans

3 討論(Discussion)

2種細胞存活率及形態學結果，在研究劑量下與對照組相比未顯示出統計學差異，但存活率呈現先增高后降低的趨勢。LDH釋放率在400 μg·mL-1劑量時明顯上升，表明細胞膜出現損傷，結合細胞凋亡結果分析，在凋亡初期，細胞應對外界刺激產生應激反應，早期凋亡細胞增多，可能部分細胞膜結構已經受到損傷。因此，在進行細胞毒性研究時，應結合2種以上試驗方法以獲得更加全面的細胞毒性效應評價。

MT具有和多種金屬離子結合的能力，包括鎘、鋅、鉛和鐵等[3-4]，利用這一特性可降低重金屬對機體的毒害，發揮解毒和調節機體生理狀態的作用[5]。線蟲是一種自由生活在土壤中的生物，以細菌為食，易于在實驗室培養且成本低廉、遺傳學背景清晰[19]，本研究選用秀麗隱桿線蟲N2作為體內毒性評價模型，探討rh-MT-Ⅲα對線蟲的毒性效應。經不同濃度(5、50和500 μg·mL-1)rh-MT-Ⅲα延長暴露48 h后，與對照組相比，線蟲運動行為(頭部擺動和身體彎曲頻率)、發育(體長)及攝食行為(咽泵頻率)各生物學終點與對照組相比未顯示出明顯差異，說明rh-MT-Ⅲα在實驗劑量下無明顯毒性效應。其結果與細胞毒性中LDH釋放率的結果不同，原因可能是由于線蟲消化道對于rh-MT-Ⅲα的消耗或因為暴露時間較短，未來需要進行rh-MT-Ⅲα對線蟲更長暴露下的毒性評價，以期更加全面地探討rh-MT-Ⅲα應用的安全性。

本研究初步探討了rh-MT-Ⅲα的細胞及線蟲毒性效應，目前，實驗室研究鋅合金屬硫蛋白作為化妝品添加劑的劑量為25 mg·kg-1[18]，本研究選用的劑量范圍是其2倍～16倍，更加確保了rh-MT-Ⅲα應用劑量的生物安全性。對于內源性及外源性MT功能的研究很多，主要認為其分子作用機制是可以降低機體氧化損傷水平及Caspase-3表達水平，通過P53通路抑制細胞凋亡[20]以起到保護功能。于立博[21]利用體內加體外實驗，驗證了外源性給予植物MT具有降低鉛毒性作用，并利用酶聯免疫法檢測了組織中MT含量，結果發現，與陽性對照組比較，高劑量干預組巰基含量顯著增加，證明外源性MT可被機體吸收，細胞實驗證實了MT對于鉛的解毒作用，但未涉及其進入細胞的方式和機體吸收。李曉偉和魯曼[22]利用含MT制劑對鉛中毒兒童進行干預，發現MT制劑能有效降低血鉛濃度，但這個試驗只是前后對照且干預前后間隔時間長，無法解釋其排鉛效用是由內源性MT過表達產生，還是外源性MT由胃腸道進入機體產生，對胃腸道對MT功能的影響試驗結果也無法解釋。徐炳政[23]體外模擬胃腸道環境，研究了胃腸道對外源性MT功能的影響，結果發現，模擬胃腸環境對酵母源MT巰基具有一定程度的破壞作用，但MT-Ⅰ與MT-Ⅱ在模擬胃腸環境中均能顯著地螯合鉛離子，并在12 h內能較好地抵抗模擬胃腸環境的消化，保持其螯合鉛離子能力。在這些外源性MT功能實驗中，其發揮作用是在胞外形成抗氧化環境而結合重金屬，還是在胞內進行分子調控，尚不明確，未來對于完整MT尤其是基因工程這種新方式制備的MT片段如何進入細胞并被組織吸收的問題，尚需進一步研究。

MT幾乎存在于所有哺乳動物中，是一類低分子量的胞內蛋白質，富含半胱氨酸，幾乎無毒。MT由于其豐富的生物學功能，應用前景十分廣闊，但由于目前動物肝臟提取這種方式獲取量極少并且純度不高，故近些年來，利用基因工程技術，采用大腸桿菌重組發酵的制備方式越來越受到關注，這種方式可大大提高MT產量和純度，但其工業制備方法殘余物可能會成為其產生毒性效應的原因。因此，對rh-MT-Ⅲα進行全面的生物安全性評價，對于確保其安全應用具有十分重要的意義。

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