2種擬除蟲菊酯類農藥對赤子愛勝蚓消化酶的毒性效應

李玲玲，沈章軍，宋玉芳，史奕

1. 合肥師范學院，合肥 230009 2. 中國科學院沈陽應用生態研究所，沈陽 110016

擬除蟲菊酯類農藥由于具有高效、對哺乳動物和鳥類低毒、且易降解等優點，已經逐漸成為有機磷、有機氯和氨基甲酸酯類殺蟲劑的替代品而被廣泛應用于農業生產和公共場所防蟲工作中[1]。根據構效學和特征學，擬除蟲菊酯類農藥被劃分為Ⅰ型和Ⅱ型[2-3]。聯苯菊酯，一種Ⅰ型擬除蟲菊酯類農藥，在農業生產中廣泛用于防治昆蟲和螨蟲[4]。氟氯氰菊酯，一種Ⅱ型擬除蟲菊酯類農藥，廣泛應用于農業、獸醫業以及家庭住宅中的防蟲過程中[5]。隨著疏水性擬除蟲菊酯類農藥的大量使用，它們被土壤顆粒和沉積物強烈吸附，從而對生態系統的結構和功能產生不可逆的損傷[6-9]。

α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase,α-Glu)是一種消化酶，可以參與有機體內碳水化合物的消化并釋放葡萄糖，具有被用作生物指標以評估環境中農藥暴露引發的生態風險的潛力[10-11]。蛋白酶是另外一類消化酶，已經在赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)體內被發現，其不僅具有水解纖維蛋白和其他蛋白成短肽或自由氨基酸的作用，也具有活化一些酶類的作用，例如凝血素和血纖維蛋白溶酶原[12-13]。前期研究主要關注蚯蚓蛋白酶的臨床應用，而將蛋白酶活性作為評估環境污染物風險指標的研究未見報道[12]。消化酶活性與有機體的攝食能力和生長能力息息相關，而在筆者團隊前期研究中發現聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下赤子愛勝蚓的體質量增長率被抑制，因此，可以將消化酶作為環境潛在毒性診斷標志物[14-16]。基于以上研究，筆者假設聯苯菊酯和氟氯氰菊酯影響了蚯蚓體內消化酶的活性，從而導致其體質量增長率被抑制。

蚯蚓是土壤生態系統中重要的分解者，影響著土壤生態系統中的分解活性、營養礦化和初級生產[17]。蚯蚓通過其行為活動能夠改善土壤結構，提高土壤透氣、排水和深層持水能力，扮演著“土壤生態系統工程師”的重要角色。生活在土壤生態系統中的蚯蚓攝取大量的土壤，可以通過皮膚和腸道直接接觸土壤污染物，已經被經濟合作與發展組織(OECD)和國際標準化組織(ISO)推薦為研究化學品對土壤生態系統無脊椎動物影響的模式生物[18-19]。目前，應用蚯蚓診斷生態毒理的研究多集中在污染物暴露對其生存、生長及繁殖等個體水平上的影響。然而，隨著生態毒理診斷的發展，蚯蚓個體水平指標已經不能滿足低劑量污染條件下的風險評估，隨之應運而生的是蚯蚓生物標志物在土壤生態系統風險評估中的應用。

本研究以模式生物赤子愛勝蚓為實驗動物，通過探究4種消化酶(α-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)的響應，評估聯苯菊酯和氟氯氰菊酯對赤子愛勝蚓的消化毒性效應，從而為進一步評估擬除蟲菊酯類農藥的土壤生態風險，闡釋其毒性機制提供基礎實驗數據支撐和理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤

土壤取自中國科學院沈陽農業生態站保護行0～20 cm土層，該土壤具有以下理化性質：pH 6.2，堿解氮(K-N)0.091%，總磷(TP)0.04%，總鉀(TK)0.18%，有機質(OM)1.65%，陽離子交換量(CEC)12.3 cmol·kg-1，最大持水量(WHC)32%。土壤的粒徑分布如下：砂粒(>50 μm)占22%，粉粒(1～50 μm)占64%，黏粒(<1 μm)占14%。土壤采集后去除植物等殘渣，室溫條件下風干，過20目篩后備用。

1.1.2 蚯蚓

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)購買于沈陽華清源蚯蚓養殖公司，挑選300～400 mg具有健康環帶的成蚓在潔凈土壤中于(20±1) ℃(光照∶黑暗比為12 h∶12 h)馴化至少2周。

1.1.3 試劑和儀器

試劑：聯苯菊酯(97%)和氟氯氰菊酯(95%)購買于上海永遠化工有限公司。牛血清蛋白(≥95%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(99.5%)、乙二胺四乙酸(EDTA)(≥99%)、二硫蘇糖醇(DTT)(99%)、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(α-pNPG)(≥99.7%)、轉化酶(≥300 units·mg-1固體)、酪蛋白(≥98%)和酪氨酸(≥99%)購買于美國西格瑪奧德里奇公司，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、醋酸(HAC)、醋酸鈉(NaAc)和硼砂(Borax)等其他試劑均為分析純，購買于沈陽萊博科貿有限責任公司。

儀器：BS210S萬分之一電子分析天平(Sartorius，德國)，HPG-280BX型光照培養箱(哈東聯，北京)，HPS-280型光照培養箱(哈東聯，北京)，10 mL手動玻璃勻漿器(凱瑞實驗器材，江蘇)，CP-80MX低溫超速離心機(Hitachi，日本)，Multiskan FC-51119000酶標儀(Thermo，美國)，高效液相色譜儀(Thermo Fisher Ultimate 3000，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 污染暴露實驗

根據前期急性毒性實驗半數致死濃度結果，設置本實驗亞致死劑量分別為：聯苯菊酯0、10、20、40、60和80 mg·kg-1；氟氯氰菊酯0、5、10、20、30和60 mg·kg-1，暴露期為28 d，其中0 mg·kg-1即為對照組。聯苯菊酯和氟氯氰菊酯溶解在50 mL丙酮中，然后撒到土壤中拌勻，平衡48 h以揮發丙酮，調節水分含量至60% WHC。每個濃度有3個重復，每個重復含有2 000 g土壤和40條蚯蚓。

1.2.2 指標測定

分別于暴露第3、7、14、21和28天，從每個重復組中取出3條蚯蚓，放于濕潤濾紙上清腸24 h，然后冰塊上解剖獲取內臟。由于赤子愛勝蚓內臟較少，因此每個重復組中取出的3條蚯蚓內臟合并為一個樣品。內臟使用0.15 mol·L-1KCl清洗，然后放于2 mL勻漿緩沖液(包含250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris pH 7.5，1 mmol·L-1DTT和1 mmol·L-1EDTA)中進行手動勻漿。勻漿液于4 ℃、15 000×g下離心30 min，取上清液用于測定消化酶活性。

α-Glu活性測定參考Agustí等[20]和Boyd[21]的方法，將80 μL內臟上清液和80 μL的10 mmol·L-1α-pNPG溶液放于96孔板內于37 ℃下孵育反應1 h，而后通過添加80 μL的15% Na2CO3溶液以終止反應，然后放于酶標儀405 nm處測定其吸光度。以轉化酶作為標準溶液，α-Glu活性表示為單位質量(mg)蛋白參與反應產生的轉化酶的量(U·mg-1protein)。

蛋白酶活性測定采用福林酚法，是在Hidalgo等[22]的方法基礎之上略作調整后的方法。酪蛋白作為蛋白酶水解作用的底物，反應緩沖液分別使用0.2 mol·L-1NaAc-0.2 mol·L-1HAC(pH 3.6)，0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4(pH 7.0)和0.05 mol·L-1Borax-0.2 mol·L-1NaOH(pH 10)。100 μL的酪蛋白水溶液(1%)、100 μL內臟上清液和100 μL反應緩沖液，放于40 ℃水浴鍋中孵育反應15 min，之后加入300 μL的0.4 mol·L-1三氯乙酸，然后放于4 ℃下靜置10 min，以10 000×g離心5 min。取離心后的100 μL上清液，加入500 μL的0.4 mol·L-1Na2CO3溶液和100 μL的福林酚顯色液充分混合，放于40 ℃水浴中顯色15 min。顯色結束后，取200 μL溶液加入96孔板中，放于酶標儀測定溶液于650 nm處的吸光度。酪氨酸溶液作為標準曲線溶液，1 U蛋白酶活性定義為在40 ℃各pH環境下單位時間(min)產生1 μg酪氨酸所需要的酶量(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)。

土壤農藥殘留量的測定根據張志勇等[23]的方法并加以改進，分別于暴露第3、7、14、21和28天取出聯苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒的土壤樣品，使用氣相色譜(GC)測定土壤中2種擬除蟲菊酯類農藥的殘留量，該部分數據已發表[15-16]。

1.3 數據統計與分析

使用SPSS 21.0進行數據分析，數據均以平均值±標準差表示，Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene檢驗用于正態分布和方差齊性檢驗。使用Dunnett多重檢驗比較各暴露時間下擬除蟲菊酯類農藥處理組與對照組之間的顯著性差異。如果數據不能滿足勻質性，使用對數轉換，如果轉換數據后依然不滿足方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H非參數檢驗進行數據分析。圖形使用SigmaPlot 12.5制作。

2 結果(Results)

2.1 聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓α-Glu活性的響應

如圖1所示，在暴露初期第3天時，20～80 mg·kg-1聯苯菊酯處理組中蚯蚓α-Glu活性增加，說明在早期聯苯菊酯能夠誘導消化酶α-Glu的水解作用。隨著時間延長，在暴露第7、14和28天，高劑量聯苯菊酯(60～80 mg·kg-1)對α-Glu活性起到抑制作用，即消化酶α-Glu的水解作用在長時間的高劑量組暴露下被干擾。如圖2所示，在暴露21 d內，除第14天外，其他暴露時間下，氟氯氰菊酯能夠顯著抑制蚯蚓體內的α-Glu活性。在暴露第28天下，氟氯氰菊酯處理組蚯蚓α-Glu活性與對照組無顯著差異。2種擬除蟲菊酯類農藥暴露下，蚯蚓α-Glu活性對氟氯氰菊酯的響應更為敏感。

圖1 聯苯菊酯暴露下蚯蚓體內α-葡萄糖苷酶活性的變化注：α-Glu表示α-葡萄糖苷酶；與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 1 Changes of α-Glu activity in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: α-Glu represents alpha-glucosidase; compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

圖2 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓體內α-葡萄糖苷酶活性的變化注：α-Glu表示α-葡萄糖苷酶；與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 2 Changes of α-Glu activity in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: α-Glu represents alpha-glucosidase; compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

2.2 聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓蛋白酶活性的響應

在聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下，蚯蚓體內3種蛋白酶活性(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)被測定。如圖3(a)所示，在暴露初期第3天時，酸性蛋白酶活性被20～80 mg·kg-1聯苯菊酯顯著誘導。隨著暴露時間的延長，誘導作用降低。如圖3(b)所示，與對照組相比，在暴露初期第3天時，中性蛋白酶活性被20～80 mg·kg-1聯苯菊酯顯著誘導，隨著暴露時間延長，高劑量組(60～80 mg·kg-1)誘導作用減弱。如圖3(c)所示，在暴露第3天，隨著濃度的增加，堿性蛋白酶活性增加，在60 mg·kg-1和80 mg·kg-1聯苯菊酯處理組達到顯著誘導，分別是對照組的1.82倍和1.84倍。同樣，隨著暴露時間延長，誘導作用逐漸減弱。從響應劑量和顯著性分析，3種蛋白酶中中性蛋白酶活性對聯苯菊酯暴露的響應更為敏感。由圖3可知，3種蛋白酶活性在暴露早期能夠顯著被聯苯菊酯誘導，揭示著它們具有早期生物標志物的潛能。

氟氯氰菊酯暴露下，3種蛋白酶活性的響應情況如圖4所示。由圖4(a)可知，暴露初期第3天時，低劑量氟氯氰菊酯處理組(5 mg·kg-1)顯著誘導了赤子愛勝蚓體內酸性蛋白酶活性，而10～60 mg·kg-1氟氯氰菊酯處理組則抑制了赤子愛勝蚓體內酸性蛋白酶活性。在整個暴露期間內，高劑量氟氯氰菊酯處理組(60 mg·kg-1)對蚯蚓酸性蛋白酶活性起到抑制作用。如圖4(b)所示，在第3天，與對照組相比，5 mg·kg-1氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓中性蛋白酶活性有所增加，隨著暴露濃度的增加，中性蛋白酶活性有所降低。暴露第7天時，高劑量氟氯氰菊酯(60 mg·kg-1)顯著抑制了蚯蚓中性蛋白酶活性，對照組活性是該處理組的1.59倍。到暴露中后期，則出現了誘導作用。由圖4(c)可知，氟氯氰菊酯對蚯蚓堿性蛋白酶的顯著影響僅僅發生在暴露早期第3天，蚯蚓堿性蛋白酶活性被5 mg·kg-1氟氯氰菊酯顯著誘導，被10 ～ 60 mg·kg-1氟氯氰菊酯顯著抑制，其中，對照組蚯蚓堿性蛋白酶活性是最高劑量組的1.37倍。隨著暴露時間延長，堿性蛋白酶活性在處理組與對照組之間沒有顯著響應差異。從響應劑量和顯著性分析，酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活性對氟氯氰菊酯的早期暴露的響應更為敏感，在暴露后期，中性蛋白酶活性對低劑量氟氯氰菊酯的響應更敏感。由圖3和圖4結果可知，在聯苯菊酯和氟氯氰菊酯早期暴露下3種蛋白酶活性主要呈現出相反的響應趨勢。

圖3 聯苯菊酯暴露下蚯蚓體內酸性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)和堿性蛋白酶(c)活性的變化注：與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 3 Changes of acid (a), neutral (b) and alkaline (c) protease activities in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: Compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

圖4 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓體內酸性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)和堿性蛋白酶(c)活性的變化注：與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 4 Changes of acid (a), neutral (b) and alkaline (c) protease activities in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: Compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

2.3 聯苯菊酯和氟氯氰菊酯殘留量與消化酶活性之間的量效關系

隨著暴露時間的延長，聯苯菊酯和氟氯氰菊酯被逐漸降解，2種擬除蟲菊酯類農藥的降解符合一級動力學模式[15-16]。為探究擬除蟲菊酯類農藥暴露下，蚯蚓體內消化酶活性與土壤殘留的擬除蟲菊酯類農藥之間的量效關系，本研究選用3種曲線擬合擬除蟲菊酯類農藥殘留量與消化酶活性的回歸方程，并進行了顯著性檢驗，P<0.05即表示曲線擬合效果較好，具有統計學意義(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

如表1所示，在聯苯菊酯暴露下，暴露初期(7 d內)消化系統3種蛋白酶活性與聯苯菊酯殘留量存在著顯著的回歸關系；暴露中后期，消化酶α-Glu活性與土壤聯苯菊酯殘留量之間存在顯著的回歸關系。如表2所示，在氟氯氰菊酯暴露下，在暴露第7天時，4種消化酶活性與氟氯氰菊酯殘留量之間存在較好的擬合方程關系；暴露中期14 d時，僅蚯蚓堿性蛋白酶活性與氟氯氰菊酯殘留量存在顯著的回歸關系；暴露后期第21天時，僅有酸性蛋白酶活性與氟氯氰菊酯殘留量存在顯著的回歸關系；最后暴露第28天時，α-Glu活性和堿性蛋白酶活性與氟氯氰菊酯殘留量之間存在顯著的回歸關系。

表1 土壤中聯苯菊酯殘留量與蚯蚓體內消化酶活性的量效關系Table 1 Dose-response relationship between bifenthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm

表2 土壤中氟氯氰菊酯殘留量與蚯蚓體內消化酶活性的量效關系Table 2 Dose-response relationship between cyfluthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm

2.4 聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下消化酶活性之間的相關性分析

生物體中各生物標志物之間不是相互獨立的，而是存在著互相調節的關系，本研究采用Pearson相關性分析方法分析蚯蚓在2種擬除蟲菊酯類農藥暴露下，其體內4種消化酶之間的相關性。如圖5所示，對照組處理下，蚯蚓α-Glu活性與蛋白酶活性之間相關性不顯著，3種蛋白酶活性之間存在顯著的兩兩正相關。如圖6和圖7所示，在聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下，蚯蚓消化系統中α-Glu、酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶活性之間呈現兩兩顯著正相關。與對照組比較可以發現，在添加聯苯菊酯和氟氯氰菊酯后，α-Glu活性與蛋白酶活性出現顯著相關性，說明2種擬除蟲菊酯類農藥的暴露能夠誘導2類不同消化酶之間發生協同作用以應對外界脅迫。

圖5 對照組處理中蚯蚓4種消化酶活性之間的Pearson相關性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms in control groupsNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

圖6 聯苯菊酯暴露下蚯蚓4種消化酶活性之間的Pearson相關性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 6 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖7 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓4種消化酶活性之間的Pearson相關性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 7 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

3 討論(Discussion)

蚯蚓消化酶(α-Glu和蛋白酶)與其攝食能力、生物增長相關，然而卻很少被用作識別環境污染物的生物標志物。本研究分析了聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露對土壤模式生物赤子愛勝蚓4種消化酶的影響。結果顯示，聯苯菊酯和氟氯氰菊酯影響了赤子愛勝蚓消化酶的活性，調節了2類不同消化酶之間的協同作用以應對暴露脅迫。

暴露在聯苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒土壤下，赤子愛勝蚓體內α-Glu活性的變化表明其體內的糖類水解在一定程度上受到擬除蟲菊酯類農藥的影響。然而關于α-Glu響應的具體分子機制依然未知，有待進一步研究。蛋白酶水解作用能夠調解有機體的發育過程、細胞內穩態和組織修復[24]。然而僅有少量研究以蛋白酶活性為端點進行污染暴露實驗，例如花園愛勝蚓(E.hortensis)白細胞溶解產物中的蛋白酶活性在暴露5 d后隨著多氯聯苯(PCBs)(1～30 μg·cm-2)濃度的增加而增加[25]。本研究中，3種蛋白酶活性在暴露早期，能夠分別被聯苯菊酯和氟氯氰菊酯顯著誘導和抑制，表明它們能夠被用作早期警示標志物以評估聯苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性效應。研究發現赤子愛勝蚓內臟中的中性和堿性蛋白酶水解活性高于酸性蛋白酶(圖3和圖4)，這一現象也出現在鯉魚和丁鯛中[22]。同一個指標在聯苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下出現不同的響應，可能與2種擬除蟲菊酯類農藥的結構差異有關。相比Ⅰ型聯苯菊酯，Ⅱ型氟氯氰菊酯的醇基團α碳上存在一個氰基團[26]。

在整個暴露期間，蚯蚓消化酶與聯苯菊酯和氟氯氰菊酯之間的相關性隨著時間發生變化，可能因為隨著時間延長，2種擬除蟲菊酯類農藥被蚯蚓及土壤微生物代謝轉化，形成一個擬除蟲菊酯類農藥母體與中間代謝產物復合污染的體系，蚯蚓生化指標的變化是母體和中間產物共同影響的一個結果。例如，聯苯菊酯代謝過程中環丙基甲酸和2-甲基3-聯苯基甲醇產生，這些代謝產物的毒性可能高于母體化合物[27]。在氟氯氰菊酯的代謝過程中會釋放出化學不穩定性的氰醇，氰醇能夠分解為氰化物和醛類，而這些化合物是自由基的來源物，可以對有機體造成損傷[28]。

綜上所述，亞致死劑量的聯苯菊酯和氟氯氰菊酯能夠引起赤子愛勝蚓的消化酶活性的紊亂，從而可能影響其生長繁殖。氟氯氰菊酯對α-Glu活性的抑制作用大于聯苯菊酯，蛋白酶活性能夠在暴露最早期指示聯苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性。在2種擬除蟲菊酯類農藥暴露下，蚯蚓體內4種消化酶之間存在著顯著的相關關系。

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