耐力運動對骨質(zhì)疏松小鼠骨量、骨形態(tài)學及Linc-ROR表達的影響

趙仁清 孫龍飛 顧莤

揚州大學體育學院，江蘇 揚州 225127

骨質(zhì)疏松癥是影響老年人健康的重要問題，骨質(zhì)疏松可增加骨折風險，并且骨折后愈合效果不佳[1]。目前我國有近2億老年人口，因此，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥成為迫切的任務(wù)。有研究表明耐力運動明顯改善骨質(zhì)疏松小鼠骨組織微觀結(jié)構(gòu)、預(yù)防骨量丟失[2-3]。機械力刺激可通過促進成骨細胞分化、增加骨合成，抑制破骨細胞分化，減少骨吸收，維持骨代謝正平衡[4-5]；但其調(diào)節(jié)機制目前還不完全清楚。Linc-ROR是新近發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼 RNA，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后多個層面修飾基因表達、調(diào)控成骨細胞分化[6]；Linc-ROR的表達受到運動的調(diào)節(jié)；張宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)耐力運動可影響小鼠腦組織Linc-ROR的表達，促進神經(jīng)組織修復(fù)。最近研究表明，Linc-ROR在多種組織中與Wnt/β-catenin信號系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控細胞增殖、分化[8-9]。鑒于Linc-ROR和Wnt/β-catenin 信號系統(tǒng)均是調(diào)節(jié)成骨細胞分化、促進骨形成的重要信號通道。因此，本研究建立小鼠骨質(zhì)疏松運動干預(yù)模型，探討linc-ROR/Wnt/β-catenin信號通道參與運動預(yù)防骨質(zhì)疏松的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與運動方案

24只三月齡C57BL雌性小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學動物中心，小鼠購進后隨機分配每籠8只，25 ℃恒溫喂養(yǎng)，自然光照，自由攝食飲水。小鼠適應(yīng)性一周后，以4%水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉，皮膚消毒后在脊柱兩側(cè)1 cm處分別切開皮膚和肌肉層，將脂肪組織、輸卵管和卵巢取出，結(jié)扎輸卵管并去除卵巢，假手術(shù)安靜組去除等量的卵巢周圍脂肪，傷口縫合。術(shù)后將24只小鼠分為3組：(1)假手術(shù)組(Sham)；(2)卵巢切除組(Ovx)；(3)卵巢切運動組(Ex)。運動組小鼠于術(shù)后第3周進行適應(yīng)性運動訓練，逐漸達到預(yù)定負荷(0.8 km/h，45 min/d；坡度：-9 ℃；5 d/周，共8 周)[3]，其余組不進行運動干預(yù)，每周記錄各組小鼠體重變化。于最后一次訓練結(jié)束24 h后采用4%水合氯醛麻醉小鼠，收集血液并存放在抗凝管，以5 000 r/min離心10 min，取上層血清置-80 ℃冰箱中保存，用于檢測血清激素及生化因子；取雙側(cè)股骨、脛骨并在-80 ℃冰箱中保存，檢測microCT、mRNA表達。本實驗由揚州大學實驗動物倫理委員會審核批準(YZUDWLL-201905-001)。

1.2 micro-CT檢測

取小鼠取右側(cè)股骨置于75%酒精中保存用于骨密度檢測。采用美國Bruker Skyscan系統(tǒng)檢測體積骨密度(vBMD)、BV/TV、Tb.Th(trabecular thickness)、Tb.N(trabecular number)和 Tb.Sp，分辨率為10 μm，

1.3 血清激素、生化因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血液激素及相關(guān)生化指標：血清雌二醇(estradiol，E2)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)。試劑盒購自江萊生物公司(上海，中國)，檢測流程按試劑盒生產(chǎn)商提供的說明書進行。

1.4 ALP 染色

左側(cè)股骨用10%乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣，石蠟包埋、切片。把切片浸入ALP孵育液(堿性磷酸酶染色液，Solarbio)，置于37 ℃孵育2～12 h。清洗2 min后，浸入硝酸鈷溶液中，37 ℃孵育5 min。流水沖洗5 min，再蒸餾水清洗。配制ALP硫化工作液，切片浸入硫化工作液中，孵育2 min。流水洗10 min，再用蒸餾水清洗，然后核固紅復(fù)染細胞核，蒸餾水清洗。400倍鏡下 ALP+成骨細胞(OB)計數(shù)。

1.5 real time RT-PCR檢測

小鼠左側(cè)脛骨用PBS清洗后，于研磨機內(nèi)液氮環(huán)境下研磨成粉，以Trizol法(Trizol試劑盒，CWBIO 康為世紀)提取總RNA(超純RNA提取試劑盒，CWBIO 康為世紀)。采用紫外分光光度計測定RNA濃度，并通過A230 nm、A325 nm和A260 nm/A280 nm的值，觀察樣本被污染的程度及RNA純度。引物序列由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司設(shè)計并合成(表1)。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of the target genes

取1 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(生命互聯(lián)公司)進行熒光定量PCR測試。95 ℃ 10 min預(yù)變性后，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles。程序運行結(jié)束以后，測得Ct值并觀察溶解曲線，實時熒光定量PCR測定系統(tǒng)自動記錄目的基因及內(nèi)參基因β-Actin的Ct值，采用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。

1.6 Western blot檢測

取右脛骨于研磨機內(nèi)液氮環(huán)境下研磨成粉，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液，于冰上勻速研磨15 min。4 ℃、13 000 r/min、離心15 min，取上清。以BCA法進行蛋白濃度測定，按試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)說明書完成。取各標本蛋白140 μg，加5×loading buffer，混勻，100 ℃煮沸15 min。將樣品加入SDS-PAGE膠中，濃縮膠100 V，分離膠120 V，恒壓電泳。采用濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，冰浴中，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜160 min。用5%BSA室溫封閉l h后，加入一抗(Wnt3a、β-catenin和β-actin，購自中杉金橋公司)，4 ℃冰箱過夜。第2天從冰箱將PVDF膜拿出，用TBST洗膜(5 min×3次)，加入二抗(購自中杉金橋公司)室溫孵育1 h。曝光顯影：60 min，TBST洗膜，取出PVDF膜，將超敏發(fā)光液(RJ239676，賽默飛公司)置于PVDF上以超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影拍照并進行分析。將Wnt3a及β-catenin的光密度值分別與相應(yīng)的β-actin比值作為其蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用組平均值±標準差進行報道，采用 one-way ANOVA方法檢測各組之間的統(tǒng)計學差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，所有數(shù)據(jù)采用 STATA15統(tǒng)計軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及血清激素、生化因子變化

三組小鼠體重在實驗前沒有顯著差異，實驗結(jié)束后Ovx小鼠體重明顯高于Sham組小鼠，運動可改善體重增加現(xiàn)象。Ovx小鼠子宮重量明顯低于對照組，運動也不能改善Ovx小鼠子宮萎縮現(xiàn)象。運動可改善Ovx小鼠血清E2、OPG下降及RANKL升高變化趨勢(表2)。

表2 實驗前后小鼠一般情況變化Table 2 Changes of characteristics of the mice before and after the experiment

2.2 骨密度、骨形態(tài)學變化

Ovx導(dǎo)致小鼠皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨 vBMD明顯下降，運動可改善骨密度下降現(xiàn)象(圖1)。Ovx小鼠骨體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)及數(shù)量(Tb.N)明顯減少，而骨小梁寬度(Tb.Sp)增加；運動明顯改善卵巢切除導(dǎo)致的這些變化(圖2)。

圖1 各組小鼠骨密度變化Fig.1 Changes of vBMD in mice in each group

圖2 各組小鼠骨形態(tài)學變化Fig.2 Changes of bone morphology in mice in each group

2.3 骨組織ALP染色

骨組織ALP染色提示，Sham組小鼠ALP+OB細胞數(shù)量較多(圖3A)，而 Ovx小鼠ALP+OB 細胞數(shù)量明顯減少(圖3B)，運動可明顯增加 Ovx小鼠骨組織中ALP+OB 細胞數(shù)量(圖3C)

圖3 各組小鼠骨組織 ALP+染色Fig.3 Changes of ALP+ in bone tissue in mice in each group

2.4 Linc-ROR、Wnt 3a和β-catenin表達變化

與 Sham 組小鼠相比，Ovx小鼠骨組織中Linc-ROR以及Wnt 3a、β-catenin mRNA水平下降，而8周運動干預(yù)可增加Linc-ROR表達，Wnt 3a和β-

catenin mRNA水平也明顯升高(表3)。Ovx小鼠Wnt 3a[(0.362±0.142)%]和β-catenin[(0.275±0.160)%]蛋白表達量下降，而運動干預(yù)可明顯改善Wnt 3a(0.896±0.462)和β-catenin(1.026±0.412)蛋白表達水平(圖4)。

圖4 各組小鼠蛋白表達變化Fig.4 Changes of proteins in mice in each group

表3 各組小鼠 Linc-ROR以及Wnt 3a、β-catenin mRNA表達變化Table 3 Changes of Linc-ROR, and Wnt 3a and β-catenin mRNAs in mice in each group

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)8周耐力運動能明顯改善卵巢切除小鼠骨量丟失、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象，并且運動還增加骨組織中ALP+OB細胞數(shù)量；運動上調(diào)Linc-ROR、Wnt 3a和β-catenin mRNA表達，提示運動可能通過調(diào)控Linc-ROR/Wnt 3a/β-catenin信號通路、增加成骨細胞合成，從而減少骨量丟失，改善骨微觀結(jié)構(gòu)。

本研究發(fā)現(xiàn)運動改善卵巢切除小鼠骨量丟失、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象的同時，增加骨組織中成骨細胞數(shù)量(ALP+OB)，表明運動可能通過促進成骨細胞合成、增加骨量、改善骨微觀結(jié)構(gòu)。運動對骨組織產(chǎn)生的機械力刺激可直接作用于骨細胞，從而促進成骨細胞合成、增加骨量積累，抑制破骨細胞合成、減少骨吸收，預(yù)防骨質(zhì)疏松[10]。機械力刺激可通過多種信號途徑調(diào)節(jié)成骨細胞分化[11-12]，但與Wnt/β-catenin最為密切。過表達LPR5(low density lipoprotein receptor-related protein 5)可上調(diào)機械力刺激促進成骨細胞分化[13]，而敲除LPR5則下調(diào)機械力刺激促進成骨細胞分化的作用[14]，這表明機械力可通過Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)節(jié)骨代謝。Armstrong等[4]進一步發(fā)現(xiàn)，機械力刺激增加β-catenin 在成骨細胞中的表達，在雌激素受體-β信號系統(tǒng)參與下促進β-catenin向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運，增加下游基因表達，促進成骨細胞分化、增強活性，增加骨形成。

有研究表明，機械力刺激還通過調(diào)控骨細胞增加OPG表達、抑制 SOST/sclerostin表達促進成骨細胞分化，減少RANKL分泌，從而抑制破骨細胞合成，維持骨代謝正平衡[15-16]。這與本研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除小鼠血清OPG降低、RANKL升高，運動可降低血清RANKL水平，增加OPG水平，提示OPG、RANKL水平可能是促進成骨細胞合成、抑制破骨細胞數(shù)量的一個重要因素。

本研究還發(fā)現(xiàn)卵巢切除導(dǎo)致骨組織中 Linc-ROR和 Wnt 3a、β-catenin mRNA表達下降，而運動可明顯上調(diào)這些基因的表達。鑒于Linc-ROR是調(diào)節(jié)成骨細胞分化的重要長鏈非編碼 RNA，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(如Runx2等)，調(diào)節(jié)成骨細胞分化[17]；并且Linc-ROR表達也受到運動的調(diào)節(jié)[7]，因此，本研究結(jié)果提示運動通過上調(diào)Linc-ROR表達，從而促進成骨細胞化、預(yù)防骨質(zhì)疏松。Feng等[6]報道Linc-ROR通過與miRNA138/145競爭結(jié)合，促進Wnt/β-catenin信號系統(tǒng)在成骨細胞中的表達，調(diào)控成骨細胞分化。本研究也發(fā)現(xiàn)，運動上調(diào)Linc-ROR表達的同時，Wnt 3a/β-catenin信號通路表達也升高。鑒于Linc-ROR與Wnt/β-catenin信號系統(tǒng)關(guān)系密切，協(xié)同調(diào)節(jié)組織代謝[18]；因此，本研究提示運動可能通過上調(diào)Linc-ROR/Wnt/β-catenin信號通路預(yù)防骨質(zhì)疏松。

4 小結(jié)與展望

本研究發(fā)現(xiàn)運動可預(yù)防骨質(zhì)疏松小鼠骨量丟失、改善骨微觀結(jié)構(gòu)，并且闡明運動可通過Linc-ROR/Wnt/β-catenin信號通路預(yù)防骨質(zhì)疏松，為尋找安全有效的骨質(zhì)疏松預(yù)防措施提供理論依據(jù)。由于本實驗主要是在體(invivo)實驗研究，尚有不足之處，比如機械力刺激上調(diào)成骨細胞內(nèi)Linc-ROR表達之后，又通過哪些分子機制調(diào)控Wnt/β-catenin信號系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)成骨細胞分化，因此，在以后研究中將開展體外(invitro)細胞培養(yǎng)實驗以闡明此分子機制。