缺氧誘導因子通過FOXC1促進腦膠質瘤細胞侵襲*

陳 威， 彭 燦， 勵 勇， 章建飛， 王新東△

（1寧波大學醫學院附屬醫院神經外科，浙江寧波315211；2寧波市臨床病理診斷中心，浙江寧波315021）

惡性膠質瘤細胞侵襲正常腦組織是造成膠質瘤不良預后的主要原因之一［1］，但膠質瘤的侵襲性機制仍待進一步探索。眾所周知，缺氧微環境是膠質母細胞瘤的特征之一，缺氧可誘導膠質母細胞瘤細胞的上皮-間充質轉換，導致腫瘤細胞形態學改變［2］，缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是與缺氧相關的最重要的轉錄因子［3-4］。HIF 轉錄因子有助于腫瘤細胞適應缺氧，在許多惡性腫瘤的研究中發現通過缺氧條件的誘導，會使HIF-2α 蛋白表達水平上調，使腫瘤細胞適應缺氧，從而促進腫瘤的發生發展［5-6］。據報道，HIF-2α 在惡性膠質瘤的化療耐藥性中也起著至關重要的作用［7］，但具體機制還不甚清楚。轉錄因子叉頭框蛋白C1（forkhead box C1，FOXC1）屬于叉頭框轉錄子基因家族的一員［8-9］。國內有文獻報道，通過過表達FOXC1 后，會促使膠質瘤細胞的侵襲能力明顯增強［10］，但缺氧條件是否能影響膠質瘤細胞中FOXC1 的表達，進而影響膠質瘤細胞的生物學特性暫無文獻報道。

本實驗初步探討了在缺氧情況下FOXC1 在膠質瘤細胞中的表達情況及HIF 對其表達的影響，進一步闡明HIF-2α 與FOXC1之間的關系，為臨床治療膠質瘤提供新的靶點和理論依據。

材料和方法

1 材料

人腦膠質瘤細胞系U87 購于ATCC；人腦膠質瘤細胞系U251 獲得于日本理化研究中心。BCA 蛋白濃度測定試劑盒、I 抗稀釋液、超敏ECL 化學顯色劑和Tween-20 購自江蘇碧云天公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco；0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM 培養基購自HyClone；二甲基亞砜（dimerthyl suifoxide，DMSO）購于北京索萊寶公司；Trizol Regent 試劑購于 Ambion；小鼠抗人 β-actin 單克隆抗體、小鼠抗人FOXC1 單克隆抗體、小鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體、兔抗人 HIF-2α 多克隆抗體、兔抗人N-cadherin 多克隆抗體、小鼠抗人vimentin 單克隆抗體和小鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體等均購自Abcam；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 購于武漢普美克生物有限公司；FOXC1和GAPDH的PCR引物購于上海生工生物工程技術服務有限公司；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾序列購自上海吉瑪公司；Transwell 小室購自Millipore；基質膠購于Sigma。PCR分析儀和電泳儀裝置購于Amersham；凝膠成像系統購自Bio-Rad。

2 主要方法

2.1 細胞培養 U87 和U251 細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養。陰性對照組在37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養，取對數生長期膠質瘤細胞置于缺氧培養箱（37 ℃、5% CO2、1% O2、94% N2）進行培養，缺氧培養的時間分別為3、12、24和48 h。并以CoCl2模擬缺氧條件，取24 孔板，每孔中接種1×104個對數生長期的膠質瘤細胞，培養24 h后，棄去原培養液，加入含CoCl2的細胞培養液，CoCl2的濃度分別為0、100、150、200和250 μmol/L，繼續培養24 h，再進行細胞RNA或者蛋白的提取。

2.2 細胞轉染 將U87 和U251 細胞接種到6 孔板中，當細胞生長狀態良好、融合度達60%～70%時，換為無胎牛血清的DMEM 培養液靜置24 h，使細胞生長同步化，24 h后換為含有2%胎牛血清的DMEM 培養基。計算所需要轉染的siRNA 的量，在200 μL DMEM 培養基中分別加入5μL siRNA 以及 8 μL 的Lipofectamine 2000，使其充分混勻；室溫下靜置18 min后加入細胞中；再按實驗需求放入相對應的正常氧或缺氧培養箱中培養，當轉染48 h后，方可行細胞RNA或者蛋白的提取。

2.3 Western blot 法檢測 U87 和 U251 瘤細胞中 HIF-1α、HIF-2α、FOXC1、N-cadherin、E-cadherin 和vimentin 的蛋白水平 吸棄細胞培養液，PBS 清洗3 次，吸凈殘余液體，6 孔板每孔中加120 μL 裂解液，置于冰上裂解5 min，用細胞刮充分刮取，將細胞裂解物收集到 1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min，提取上清液，加入5×上樣緩沖液，煮沸后經SDSPAGE 分離蛋白；上膠恒壓 80 V，42 min，下膠恒壓120 V，65 min。轉膜恒流300 mA、60 min；50 g/L脫脂牛奶常溫封閉1 h。TBST 洗膜后，分別加小鼠抗人β-actin 抗體（1∶4 000）、小鼠抗人FOXC1 單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人HIF-2α 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人N-cadherin 多克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人vimentin 單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；回收Ⅰ抗，TBST洗滌后，分別加入相應的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后用增強化學發光法顯色，經Bio-Rad凝膠成像系統曝光，用Image Lab 6.1軟件分析圖像。

2.4 Transwell 侵襲和遷移實驗檢測 U87 和 U251 細胞的侵襲能力 按試劑盒說明書操作，進行基質膠的制備：從-80 ℃冰箱中提前將Matrigel 膠取出后放至4 ℃的冰箱過夜，使其由固態變為液態；將液態的Matrigel 膠和無血清培養基充分混勻，混勻體積比為1∶3，將體積為 80 μL 的 Matrigel 膠稀釋后加入到上室，使其均勻的鋪至上室的底部，放入37 ℃的培養箱，使得Matrigel 膠凝固。用移液吸槍將細胞懸液加入鋪有Matrigel 膠的Transwell 小室的上室中，量約200 μL。將 Transwell 小室放至 24 孔板中，孔板內形成Transwell 的下室，在每個Transwell 小室的下室加入500 μL 含有20%胎牛血清的DMEM 高糖培養基，再將小室放至37 ℃的細胞培養箱進行孵育。經過24 h 的孵育后，將小室從細胞培養箱中取出，用潔凈的醫用棉簽將小室上室中的細胞輕輕拭去，用PBS緩沖液將Transwel 小室的上室清洗3 次，用4%的多聚甲醛固定細胞20 min，再用PBS 緩沖液洗滌3 次。將小室內的細胞用0.1%的結晶紫染色20 min，然后用PBS 緩沖液反復沖洗3 次，用顯微鏡取3 個獨立的視拍野照計數，計算平均值。

2.5 RT-qPCR檢測FOXC1的mRNA水平 用Trizol 試劑從細胞中提取總RNA。然后根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作逆轉錄合成cDNA。逆轉錄之后獲得的cDNA 按照天根SuperReal熒光定量預混試劑盒的20 μL 體系操作，按照 2-ΔΔCt方法計算 RNA 的相對表達量。使用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 統計軟件統計分析數據。計數資料用均數±標準差（mean±SD）表示。每組實驗均獨立重復3 次。多組間的比較使用單因素方差分析，方差分析后各組均數間使用q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 在膠質瘤細胞系中，FOXC1、HIF-1α 和HIF-2α隨缺氧時長增加及加入CoCl2濃度的增加而表達逐步上升

為了探尋缺氧環境下FOXC1 在膠質瘤細胞系中的表達水平，分別在正常氧條件下及缺氧3、12、24和48 h 條件下培養膠質瘤細胞系U87 和U251，通過RT-qPCR 檢測 FOXC1 的 mRNA 表達，通 過 Western blot 實驗檢測 HIF-1α、HIF-2α 及 FOXC1 蛋白的表達水平。Western blot 結果顯示，在膠質瘤細胞系U87和U251 中，缺氧條件下HIF-1α、HIF-2α 和FOXC1 蛋白表達水平與正常氧條件相比均明顯升高（P＜0.05），見圖 1A。RT-qPCR 結果顯示，在缺氧條件下，在膠質瘤細胞系U87 和U251 中FOXC1 的mRNA表達水平與正常氧條件相比均明顯升高，且隨缺氧時間延長，FOXC1 的 mRNA 表達逐步升高（P＜0.05），見圖1B。應用HIF 誘導劑CoCl2模擬缺氧條件，發現CoCl2處理的膠質瘤U87 和U251 細胞系中FOXC1 的 mRNA 表達水平及 FOXC1、HIF-1α 和 HIF-2α 的蛋白表達水平均較陰性對照組明顯升高，且升高水平與加入CoCl2的濃度呈正相關（P＜0.05），見圖1C、D。這些實驗結果證實缺氧環境能誘導FOXC1的表達，HIF-1α 和 HIF-2α 可能參與缺氧環境下FOXC1的表達上調。

Figure 1.The expression of FOXC1 at mRNA and protein levels，and the protein levels of HIF-1α and HIF-2α in the glioma U87 cells and U251 cells under normoxic and hypoxic conditions.A，C：the images and quantitative analysis by Western blot for determining the protein levels of HIF-1α，HIF-2α and FOXC1；B，D：the mRNA expression of FOXC1 detected by RT-qPCR detection.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 0 μmol/L CoCl2 group.圖1 常氧和缺氧環境下，FOXC1、HIF-1α和HIF-2α在膠質瘤細胞中的表達

2 缺氧環境下HIF-2α上調FOXC1的表達水平

為了探尋 HIF-1α 和 HIF-2α 在缺氧環境下對FOXC1 表達水平的影響，我們在膠質瘤細胞系U87和 U251 中分別敲減HIF-1α和HIF-2α的表達水平，通過Western blot 實驗發現，正常氧條件下，轉染HIF-1αsiRNA（siHIF-1α）和HIF-2αsiRNA（siHIF-2α）后，細胞中FOXC1 蛋白的表達水平無明顯變化。而轉染 siHIF-1α 后，缺氧條件下細胞中HIF-1α 蛋白表達較對照組明顯降低（P＜0.05），而FOXC1 蛋白的表達水平無明顯變化（圖2A）；但在轉染siHIF-2α后，缺氧條件下培養的膠質瘤細胞中FOXC1 以及HIF-2α 的蛋白表達水平均較陰性對照組下降（P＜0.05），見圖2B。進一步證實缺氧環境下FOXC1 的上調與HIF-2α表達相關。

Figure 2.Western blot was used to detect the protein expression of FOXC1 under hypoxia when knock-down of HIF-1α and HIF-2α in glioma cell lines U87 and U251 after transfection of HIF-1α siRNA（A）and HIF-2α siRNA（B），respectively.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs hypoxia group.圖2 缺氧環境下，分別敲減膠質瘤細胞中HIF-1α或HIF-2α表達后的FOXC1蛋白的表達變化

3 缺氧環境下下調FOXC1表達水平抑制膠質瘤細胞侵襲能力

分別在常氧和缺氧條件下培養膠質瘤細胞系U87和U251，Transwell實驗發現，與常氧條件下相比，缺氧條件下膠質瘤細胞系侵襲能力明顯增強；缺氧條件下轉染FOXC1siRNA（siFOXC1）后，與缺氧組相比侵襲能力明顯減弱（P＜0.05），見圖3A。通過Western blot 實驗繼續探尋缺氧環境下FOXC1 與細胞上皮間質化轉錄因子 N-cadherin、E-cadherin 和 vimentin 的關系。如圖3B 所示，膠質瘤細胞系U87和U251在缺氧環境下，與常氧環境相比，間質化標記蛋白N-cadherin和vimentin表達明顯上升，而上皮標記蛋白E-cadherin的表達明顯下降（P＜0.05）；缺氧環境下，敲減FOXC1的表達會降低N-cadherin和vimentin表達，升高E-cadherin 的表達（P＜0.05）。這些結果說明在缺氧條件下，FOXC1的表達變化與腫瘤的侵襲能力息息相關。

Figure 3.The changes of the invasive ability and the protein expression of N-cadherin，E-cadherin and vimentin in U87 and U251 cells with knock-down of FOXC1 expression.A：representative images and quantitative analysis showed that the invasive ability of glioma cell lines U87 and U251 was changed after knock-down of FOXC1 expression under normoxic and hypoxic conditions（×200）；B：Western blot was used to detect the changes of FOXC1，N-cadherin，E-cadherin and vimentin protein levels in glioma cell lines U87 and U251 after knock-down of FOXC1 expression under normoxic and hypoxic conditions.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia group；#P＜0.05 vs hypoxia group.圖3 缺氧環境下，敲減FOXC1表達后膠質瘤細胞的侵襲能力以及N-cadherin、E-cadherin和vimentin蛋白表達的變化

討 論

腦膠質瘤是來源于神經上皮的一種最常見的腫瘤，占所有原發性腦和中樞神經系統腫瘤的24%［11］。盡管目前對腦膠質瘤的治療方法取得了很大的進展，但是由于惡性膠質瘤侵襲能力強這一特點導致外科治療及放化療后腫瘤容易復發，以至于患者的預后仍極差，膠質瘤的總體治療效果并不理想［12-14］。因此當前對于抑制膠質瘤細胞高度侵襲能力的相關研究迫在眉睫。

腫瘤生長的微環境中缺氧是其一個基本的特征［15-16］。腫瘤細胞在低氧條件下可以通過激活適應性反應繼續存活［17-18］。缺氧誘導因子是與缺氧相關的最重要的轉錄因子，在缺氧條件下，起著傳遞缺氧信號、介導缺氧效應的重要作用［19-20］。HIFs 是一個異二聚體復合物，由 HIF-α 和 HIF-β 組成，HIF-β 是一個穩定的亞基，HIF-α 是親氧亞基［21-22］。哺乳動物的 HIF-α 有 3 種 亞型 ，即 HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α［3-4］。目前研究表明 HIF-2α 的高度表達與乳腺癌和小細胞肺癌的侵襲及轉移有關，其機制可能是HIF間接或直接誘導上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［23］。HIF-2α過度表達也是預測肝癌、大腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腦部腫瘤和卵巢癌等惡性腫瘤不良預后的重要相關標志物［24］。

叉頭框（forkhead box，FOX）家族成員的分子結構都有一個明顯的叉頭和螺旋翼狀DNA 結合區域，其是錄轉因子的大家族，家族成員眾多，參與調控基因的表達，與細胞的生長周期、增殖、分化、遷移、新陳代謝、DNA 的損傷應答及腫瘤的發生發展有著重要的關系［25-27］。人類叉頭框基因家族成員的命名從FOXA 到 FOXS，有著不同的功能與結構［28］。轉錄因子FOXC1 屬于叉頭框轉錄子基因家族的一員［8-9］。目前FOXC1 蛋白的功能還不是十分清楚，現已有文獻報道FOXC1 的表達缺失可促進上皮性卵巢癌發生 EMT［29］。國內有文獻報道，過度表達 FOXC1 后膠質瘤細胞的侵襲能力明顯增強［10］，但其具體機制還不甚清楚。

本實驗中，與常氧培養相比，缺氧環境下培養的膠質瘤細胞的侵襲能力明顯增強，FOXC1 的表達水平明顯上調，而FOXC1沉默則會降低N-cadherin、vimentin 表達，升高E-cadherin 的表達，抑制了缺氧條件下增強的侵襲能力，證實了FOXC1 的表達與膠質瘤細胞的侵襲能力息息相關。其次發現在膠質瘤細胞中，隨缺氧時間的延長以及加入CoCl2濃度的增加，不僅FOXC1 的表達水平不斷上調，HIF-1α、HIF-2α 的表達水平也逐步上升，由此，猜想 FOXC1 與HIF-1α、HIF-2α 兩者之間存在聯系。我們分別轉染HIF-1α siRNA 和 HIF-2α siRNA 進行驗證，結果顯示轉染 HIF-1α siRNA 后，FOXC1 蛋白表達水平無明顯變化，但在轉染HIF-2α siRNA后，缺氧條件下培養的膠質瘤細胞中FOXC1 的蛋白表達水平較陰性對照組下降。證實缺氧環境下FOXC1 的上調與HIF-2α表達相關，進一步驗證了缺氧條件下HIF-2α 可以通過調控FOXC1 表達從而改變膠質瘤細胞的侵襲能力，明確了HIF-2α/FOXC1調節軸在缺氧環境下膠質瘤細胞侵襲中的作用。