TLR4/NF-κB信號通路對CBS+/-小鼠非酒精性脂肪性肝病的影響*

熊建團 ， 顧鈴毓 ， 王青青 ， 丁 寧 ， 董小艷 ， 劉達越 ，徐靈博 ， 焦 運 ，4， 姜怡鄧 △

（1寧夏醫科大學基礎醫學院，2寧夏醫科大學臨床醫學院，3國家衛生健康委代謝性心血管疾病研究重點實驗室，寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室，4寧夏醫科大學總醫院，寧夏銀川750000）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性代謝性綜合征，其特征是非酒精性因素引起的肝細胞內脂肪變性［1］，其發病率在我國常見的肝臟疾病中較高［2］。肝臟是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）合成和代謝的重要調節器官。已有研究表明慢性肝病、肝硬化和肝癌等肝臟疾病患者血漿Hcy濃度顯著升高［3］，因此Hcy在NAFLD中的作用日益受到重視。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是人類發現的第1個TLR相關蛋白［4］。作為識別細胞表面病原的分子之一，TLR4 被激發后通過一系列信號轉導激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），誘導肝細胞壞死、炎癥和纖維化［5］，但TLR4/NF-κB 信號通路是否在胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）基因雜合敲除（CBS+/-）小鼠NAFLD的形成過程中發揮作用仍需進一步探索。因此，本研究主要探討TLR4/NF-κB通路對NAFLD的影響，以期為防治NAFLD提供新的研究思路。

材料和方法

1 材料

Avanti J-30I 型高速低溫離心機（Beckman Coulter）；超純水儀（Millipore）；相差顯微鏡（Olympus）；FTC-3000型實時熒光定量PCR儀（Funglyn Biotech）；電泳儀、電轉儀和凝膠成像系統（BIO-RAD）。RPMI-1640 培養基和胎牛血清（Gibco）；RNA 提取試劑盒（北京天根技術有限公司）；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；抗TLR4 抗體和抗NF-κB 抗體（Abcam）；總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蛋白提取試劑盒（北京天根技術有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠的飼養及分組 實驗動物購于北京維尚利德公司，隨機選取4 周齡CBS基因正常（CBS+/+）小鼠（n=6）及CBS+/-小鼠（n=6）均給予高蛋氨酸飲食。

2.2 小鼠血清TC、TG和Hcy濃度的檢測及肝指數的計算 將CBS+/+組和CBS+/-組小鼠禁飲食12 h 后稱重，麻醉并眼球取血，靜置30 min 后分離血清。將血清樣本交予金域醫學檢驗集團股份有限公司，應用全自動生化儀檢測血清中TC、TG 和Hcy 水平。隨后將小鼠開腹并分離肝臟，用生理鹽水清洗肝臟后稱重（g），并計算肝指數。肝指數（%）=肝重/體重×100%。

2.3 小鼠肝臟組織TC 及TG 含量的測定 稱取肝組織100 mg，用冷的生理鹽水漂洗后加入1.9 mL 勻漿介質，冰浴下使用勻漿器（2 000 r/min）勻漿5 min后離心吸取上清即為10%肝勻漿。使用GPO-PAP法檢測勻漿中的TC和TG含量。

2.4 HE 及油紅O 染色檢測肝組織形態的變化 取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的肝組織，用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片機切厚度為5 μm的片子。HE 染色后，光鏡下觀察肝臟形態學的改變，每張切片觀察5 個視野。取肝臟的冰凍切片進行油紅O染色，肝細胞核呈紫藍色，脂滴呈紅色。

2.5 RT-qPCR 檢測肝臟組織中 TLR4 及 NF-κB 的mRNA 表達 按照總RNA 提取說明書提取肝組織RNA，逆轉錄為cDNA，通過熒光定量PCR 儀進行擴增。由上海生工生物工程股份有限公司設計引物。TLR4 的上游引物序列為5'-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3'，下游引物序列為5'-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3'，擴增產物 147 bp；NF-κB 的上游引物序列為5'-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3'，下游引物序列為5'-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3'，擴增產物 104 bp；內參照GAPDH 的上游引物序列為5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'，擴增產物 183 bp。反應條件為：95 ℃預變性10 min；擴增階段95 ℃變性5 s、60 ℃退火 20 s、72 ℃延長 30 s，50 個循環。采用 2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 的相對表達量，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt待測樣品-ΔCt校正樣品。

2.6 Western blot 檢測 TLR4 和 NF-κB 蛋白的表達水平 取100 mg肝臟組織，剪碎，加入1 mL PMSF 裂解液，用勻漿器在冰上勻漿數秒，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液以BCA 法進行蛋白濃度測定；取等量蛋白與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min后進行SDS-PAGE（濃縮膠恒壓80 V，30 min；分離膠恒壓120 V，1 h）；4 ℃、恒流0.3 A、2 h 電轉移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗膜；分別加入兔抗人TLR4和NF-κB 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，PBST洗膜；加入對應的Ⅱ抗（1∶5 000）放置4 ℃過夜，PBST洗膜后進行曝光。采用Image Lab 軟件對TLR4 和NF-κB及β-actin的灰度值進行分析。

3 統計學處理

計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 兩組小鼠血清Hcy水平的變化

與CBS+/+組小鼠相比，CBS+/-組小鼠血清中Hcy水平升高且差異具有統計學意義（P＜0.05），表明高同型半胱氨酸血癥動物模型誘導成功，見圖1。

Figure 1.The serum levels of Hcy in CBS+/+ and CBS+/- groups.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs CBS+/+group.圖1 CBS+/+組與CBS+/-組小鼠血清Hcy水平的比較

2 兩組小鼠肝指數的比較

與CBS+/+組小鼠相比，CBS+/-組小鼠的肝指數顯著升高（P＜0.05），提示 Hcy 引起肝臟重量增加，見圖2。

Figure 2.Liver-to-body weight ratio of the mice in CBS+/+and CBS+/-groups.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs CBS+/+group.圖2 CBS+/+組與CBS+/-組小鼠肝體比

3 小鼠肝臟組織和血清中TC及TG含量的比較

與CBS+/+組比較，CBS+/-組小鼠肝組織（圖3）及血清（圖 4）中 TG 和 TC 含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），表明Hcy能夠提高血脂水平。

Figure 3.The contents of TC and TG in liver tissue.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs CBS+/+group.圖3 肝組織中TC和TG含量的比較

Figure 4.The contents of TC and TG in serum.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CBS+/+group.圖4 血清中TC和TG含量的比較

4 兩組小鼠肝臟組織形態變化的比較

將HE 及油紅O 染色切片置于低倍鏡下觀察，結果顯示CBS+/+組小鼠肝小葉界限較清楚，細胞分布于中央靜脈周圍，大小較一致，可見肝竇，無脂肪變性。CBS+/-組小鼠肝細胞脂肪變性明顯，細胞質可見大小不等的圓形空泡，偶爾可見重度脂肪變性，且小葉內因炎癥細胞浸潤，可引起壞死灶融合成片。見圖5。

Figure 5.HE and oil red O staining of liver tissue（scale bar=500 μm）.The transparent vesicles shown by the black arrows represent lipid droplets，the red represents the cytoplasm，and the blue represents the nucleus in HE staining.Red represents lipid droplets，and blue represents cell nuclei in oil red O staining.圖5 肝組織的HE及油紅O染色觀察

5 兩組小鼠肝組織中 TLR4 和 NF-κB 的 mRNA 和蛋白表達水平的比較

與CBS+/+組比較，CBS+/-組小鼠肝組織 TLR4 和NF-κB 的mRNA（圖6）及蛋白（圖7）表達水平均顯著升高（P＜0.01）。

Figure 6.The mRNA expression of TLR4 and NF-κB in the liver tissues.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs CBS+/+group.圖6 肝組織中TLR4和NF-κB的mRNA表達

Figure 7.Protein expression of TLR4 and NF-κB in the liver tissues.Mean±SD. n=6.*P＜0.01 vs CBS+/+group.圖7 肝組織中TLR4和NF-κB的蛋白表達

6 TLR4和NF-κB表達與TC和TG的相關性分析

為進一步驗證 TLR4 及 NF-κB 與 NAFLD 發生的相關性，對CBS+/-組小鼠TLR4 蛋白表達與TC 和TG含量進行相關性分析。結果顯示，TLR4 蛋白表達與TC 和TG 含量呈正相關（r2=0.623 6，r2=0.707 6），NF-κB蛋白表達與TC和TG含量呈正相關（r2=0.812 3，r2=0.751 2），見圖 8。表明 TLR4/NF-κB 信號通路與NAFLD的發生密切相關。

Figure 8.Analysis of the correlation between the protein expression of TLR4/NF-κB and the content of TC/TG in liver tissue.圖8 肝組織中TLR4和NF-κB蛋白表達與TC和TG含量的相關性分析

討 論

隨著生活方式和飲食結構不斷改變，我國人口肥胖程度不斷增加，導致NAFLD 患病率出現快速且大規模增長，而其發生和發展的機制尚不完全清楚［6］。作為一種常見慢性肝臟疾病，NAFLD 包含多種肝臟組織學異常，其特征為炎癥產生和組織損傷。NAFLD 起始于甘油三酯在肝細胞中的堆積，進而引起脂肪變性或非酒精性脂肪肝形成，后期可進展為非酒精性脂肪性肝炎，如不進行干預治療，最終可導致纖維化及肝細胞癌等疾病產生［7］。有研究表明NAFLD 的發生發展與“多重打擊”學說中氧化應激，脂質過氧化等多種病理過程有關［8］。

本研究發現CBS+/-小鼠中肝臟與體重比值及TC和TG 含量增加，脂肪變性明顯，表明CBS缺乏可引起NAFLD的形成。CBS是一種存在于轉硫途徑中重要的催化酶，其基因突變使得酶活性降低或缺乏，進一步導致血漿 Hcy 水平升高［9］，Hcy 升高可以改變細胞內的脂質代謝并促進肝脂肪積蓄［10］。因此，CBS缺乏可導致肝臟脂肪變性和肝功能障礙，其機制涉及肝臟中毒性同型半胱氨酸的積累或缺乏細胞保護性的胱硫氨酸和H2S的生成等過程［11］。

TLRs 是近年來發現的一類模式識別受體，通過識別病原相關分子，激活天然免疫，最終產生一系列炎癥細胞因子釋放和啟動適應性免疫應答［12］。NF-κB 是TLR4 信號通路的下游效應蛋白，一種普遍存在且重要的核轉錄因子［13］。通過檢測，我們發現CBS缺乏可引起 Hcy 升高，進而激活 TLR4/NF-κB 信號通路，且NF-κB 信號通路與NAFLD 的發生密切相關。在內皮細胞中，Hcy 可通過增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生進而促進炎癥細胞因子的表達，其機制涉及上調NF-κB［14］，同時已有研究表明 ROS 的大量產生能夠促進 TLR4 表達升高［15］。因此，我們將繼續探索Hcy 引起NAFLD 的發生是否與氧化應激及TLR4/NF-κB信號通路相互作用有關。

綜上所述，本研究表明TLR4/NF-κB 信號通路可能在CBS+/-小鼠非酒精性脂肪肝的形成中扮演著重要作用。