黃芩苷通過抑制HMGB-1減少U937巨噬細(xì)胞的M1型極化和減輕小鼠的急性肺損傷*

楊 冰， 朱路明， 江麗麗， 王 菁△， 覃 元

（1武漢市第八醫(yī)院呼吸科，湖北武漢430010；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢430071）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種炎性肺部疾病，常由感染、敗血癥或局部缺血/再灌注損傷引起，其特征是由于中性粒細(xì)胞浸潤和促炎細(xì)胞因子和趨化因子分泌，造成肺水腫、炎癥、肺泡-毛細(xì)血管膜損傷以及富含蛋白質(zhì)的液體滲入肺泡區(qū)域［1］。急性肺損傷作為一種急性炎癥疾病，可使位于肺上皮的中性粒細(xì)胞遷移以及促炎和細(xì)胞毒性介質(zhì)釋放，并導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素 1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8、IL-10 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），從而刺激炎癥發(fā)展并最終導(dǎo)致肺纖維化［2-3］。這種炎癥過程導(dǎo)肺泡表面活性劑失活并引起I 型和II 型肺泡上皮細(xì)胞死亡，增加屏障通透性并降低肺泡液清除率，使大分子進(jìn)入間隙，引起肺水腫［4］。巨噬細(xì)胞作為急性肺損進(jìn)程的重要參與者，可極化為M1 和M2 兩種表型，M1 巨噬細(xì)胞為有利于炎癥的形態(tài)，能產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子［5］。高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box protein-1，HMGB-1）是一種脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）結(jié)合蛋白，介導(dǎo)炎癥發(fā)生，與急性肺損傷的發(fā)展密切相關(guān)［6-7］。并且有研究表明，HMGB-1 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M1 表型轉(zhuǎn)化［8］。所以HMGB-1 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化可能是急性肺損傷的關(guān)鍵病理進(jìn)程和潛在治療靶點(diǎn)。

黃芩苷（baicalin；5，6-二羥基-7-O-葡糖醛酸黃酮苷）是從黃芩中提取的黃酮類化合物，用于治療支氣管炎、腎炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎、肝炎等疾病［9］。近年已有許多針對黃芩苷的研究，但是黃芩苷對急性肺損傷的治療作用機(jī)制尚未完全明確［10-11］。黃芩苷有良好的抗炎作用，而巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)在急性肺損傷中發(fā)揮巨大作用，有研究表明黃芩苷可以通過抑制 HMGB-1 減輕神經(jīng)炎癥［12-13］，故推測其可以通過HMGB-1 減少肺部巨噬細(xì)胞的M1 型極化發(fā)揮保護(hù)作用［14］。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人單核細(xì)胞系U937 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。昆明小鼠購于南京君科生物工程有限公司（動(dòng)物合格證號為RAWMX-90021）。RPMI-1640 培養(yǎng)液和新生胎牛血清購自Gibco；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）購于Sigma；黃芩苷購于上海麥克林公司；LPS 購于 Sigma；HMGB-1 中和抗體（HMGB-1 neutralizing antibody，HMGB-1 Ab）購 于Arigo；HMGB-1 抗體、CD86 抗體和 HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗購于 CST；Trizol RNA 分離試劑購于 Thermo Fisher；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購于Ta-KaRa；CCK-8 試劑盒購于 AbMole；IL-1β 和 TNF-α ELISA試劑盒購于廈門慧嘉生物。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U937 細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5 % CO2恒溫培育箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代。將U937細(xì)胞用50 μg/L PMA 處理24 h 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞樣分化。細(xì)胞分為：（1）對照（control）組：給予等量 PBS；（2）模型（LPS）組：加入 LPS 終濃度 1 mg/L 孵育 6 h；（3）黃芩苷組：用黃芩苷 50 μmol/L 孵育 1 h 后，再加入 LPS 終濃度 1 mg/L 孵育 6 h；（4）HMGB1 中和抗體 10 mg/L孵育1 h后，再加入LPS終濃度1 mg/L孵育6 h.

2.2 Western blot檢測蛋白水平 細(xì)胞給藥處理后，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，然后用RIPA 緩沖液溶解細(xì)胞。裂解液于4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量得到蛋白樣品。樣品進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜于聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用8%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，封閉后用稀釋后的抗體于4 ℃孵育，隨后孵育相應(yīng)Ⅱ抗。最后用ECL成像系統(tǒng)發(fā)光顯影。

2.3 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 給藥處理后，加入Trizol RNA分離試劑提取細(xì)胞RNA 后，提純RNA，測量RNA 濃度，按照說明書要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的程序?yàn)椋侯A(yù)變性 95 ℃ 30 s；變性 95 ℃5s，退火/延伸60 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。測定結(jié)果用 2-ΔΔCt計(jì)算方法處理數(shù)據(jù)。IL-1β 的上游引物序列為5'-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3'，下游引物序列為5'-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3'；TNF-α的上游引物序列為5'-AGCCGATGGGTTGTACCT-3'，下游引物序列為5'-TGAGTTGGTCCCCCTTCT-3’；β-actin 的上游引物序列為5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'，下游引物序列為5'-CAGGGCAGTGATCTCCTTCT-3'。

2.4 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞進(jìn)行給藥處理后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液清洗后，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞CD86的表達(dá)。

2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞進(jìn)行給藥處理后，將原細(xì)胞上清液棄掉，按照CCK-8 試劑盒要求，加入以培養(yǎng)基：CCK-8 液=10∶1 新配的 CCK-8 溶液，放回孵箱中孵育到顏色深淺合適時(shí)結(jié)束孵育。使用多模式讀取器在波長450 nm 處測量吸光度（A）值，以吸光度計(jì)算細(xì)胞活力。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雄性昆明小鼠30 只，隨機(jī)分為3組：（1）對照組：一次性給予3 mg/kg 生理鹽水腹膜內(nèi)注射；（2）模型組：一次性給與3 mg/kg LPS 腹膜內(nèi)注射；（3）黃芩苷處理組：每天100 mg/kg 黃芩苷灌胃，第10 天給與3 mg/kg LPS 腹膜內(nèi)注射。48 h 后處死小鼠，并用Hanks 緩沖液灌注小鼠肺后收集肺泡灌洗液。小鼠處死后將肺切下，吸干稱重以獲得“濕重”，然后將其置于80 ℃的干燥箱中48 h 以獲得“干重”。計(jì)算肺濕重與干重的比率以評估組織水腫。

2.7 ELISA 實(shí)驗(yàn) 將收集好的肺泡灌洗液于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清，按照制造商的說明使用IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒進(jìn)行測定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的方式表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并進(jìn)一步采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩組間數(shù)據(jù)差異的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩苷抑制LPS誘導(dǎo)的U937巨噬細(xì)胞向M1極化

與對照組相比，U937 巨噬細(xì)胞用LPS 處理后，HMGB-1 蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05），相較于LPS組，用黃芩苷處理后HMGB-1 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05），見圖1A。與對照組相比，LPS 處理后，U937巨噬細(xì)胞的 M1 表型標(biāo)志物 IL-1β 和 TNF-α 的 mRNA水平明顯上升（P＜0.01）；相較于LPS 組，用黃芩苷處理后M1 表型標(biāo)志物明顯下降（P＜0.01），見圖1B、C。與對照組相比，用LPS 處理的U937 巨噬細(xì)胞CD86表達(dá)水平顯著上升［（88.5±12.3）%vs（6.5±1.2）%，P＜0.05］，相較于LPS 組，黃芩苷處理組U937 巨噬細(xì)胞 CD86 表達(dá)水平顯著下降［（72.5±10.4）%vs（88.5±12.3）%，P＜0.01］，見圖1D。

Figure 1.Baicalin inhibited LPS-induced U937 macrophage polarization to M1.A：Western blot was used to detect the expression of HMGB-1 protein in each group；B：RT-qPCR detection of IL-1β mRNA；C：RT-qPCR detection of TNF-α mRNA；D：flow cytometry was used to detect the expression of CD86.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs LPS group.圖1 黃芩苷抑制LPS誘導(dǎo)的U937巨噬細(xì)胞向M1極化

2 黃芩苷增加LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞活力

使用CCK-8 實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞活力，與對照組相比，LPS 組的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01），而黃芩苷處理組的細(xì)胞活力相較于LPS 組明顯上升（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Baicalin enhanced the viability of U937 macrophages.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs LPS group.圖2 黃芩苷提升U937巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力

3 HMGB1 Ab 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 U937 巨噬細(xì)胞向M1極化

將HMGB-1 Ab加入炎癥模型的U937細(xì)胞中，結(jié)果表明，與LPS 組相比，HMGB-1 Ab 可以明顯降低LPS 造成的M1 表型標(biāo)志物的mRNA 水平上升（P＜0.01），見圖3A、B。同時(shí)，HMGB-1 Ab 可以明顯降低LPS 誘導(dǎo)的 CD86 高表達(dá)［（64.7±8.2）%vs（74.1±7.5）%，P＜0.05］，見圖3C。

Figure 3.HMGB-1 neutralizing antibody（HMGB-1 Ab）inhibited LPS-induced U937 macrophage polarization to M1.A and B：RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of IL-1β and TNF-α，respectively；C：the expression of CD86 was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs LPS group.圖3 HMGB-1中和抗體抑制LPS誘導(dǎo)的U937巨噬細(xì)胞向M1極化

4 黃芩苷緩解急性肺損傷模型小鼠的肺部炎癥

與對照組相比，模型組的肺濕干重比顯著增加（6.8±1.4vs3.7±0.8，P＜0.01），而黃芩苷處理組的肺濕干比較模型組明顯降低（5.5±1.2vs6.8±1.4，P＜0.05），見圖4A。與對照組相比，模型組的HMGB-1 和M1 表型標(biāo)志物明顯增多（P＜0.05），而黃芩苷處理組與模型組相比明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖4B～D。

Figure 4.Baicalin attenuated lung inflammation in acute lung injury model mice.A：lung wet/dry（W/D）weight ratio of the mice in each group；B，C and D：the concentrations of HMGB-1，IL-1β and TNF-α in the alveolar lavage fluid were measured by ELISA，respectively.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖4 黃芩苷減輕急性肺損傷模型小鼠的肺部炎癥

討 論

急性肺損傷是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，患者治療預(yù)后差，死亡率高。臨床主要表現(xiàn)為雙側(cè)彌漫性肺浸潤，肺水腫，引起低氧血癥，肺順應(yīng)性降低和有效余氣量降低［15-16］。急性肺損傷是由肺部損傷造成的全身性炎癥反應(yīng)發(fā)展而成。越來越多的證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞在急性肺損傷發(fā)病的過程中發(fā)揮了重要的作用，肺泡巨噬細(xì)胞和從血液中募集的巨噬細(xì)胞都參與其中［17-18］。巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)發(fā)展過程中具有多方面作用。通常，它們在早期發(fā)揮促炎作用，而在晚期發(fā)揮抗炎作用。按照對環(huán)境刺激的反應(yīng)進(jìn)行分類，巨噬細(xì)胞有兩種極化狀態(tài)：經(jīng)典激活表型（M1）和交替激活表型（M2），M1 巨噬細(xì)胞的特征是高抗原呈遞和促炎細(xì)胞因子（如IL-1β，IL-12，IL-23 及 TNF-α）的高表達(dá)，M1 型巨噬細(xì)胞與炎性，清除微生物和腫瘤細(xì)胞活性有關(guān)［19-20］。在急性肺損傷中，外周血單核細(xì)胞被募集到肺泡腔中，分化為具有M1表型的巨噬細(xì)胞［21］。過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷，已有研究表明，消除肺部巨噬細(xì)胞或消耗促炎細(xì)胞因子可以減輕肺損傷［16］。表明巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化是急性肺損傷治療中一個(gè)潛在靶點(diǎn)。HMGB-1 是一種LPS 結(jié)合蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子［22］。有研究證明，在自身免疫性心肌炎模型小鼠中，HMGB-1 促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向 M1 樣表型的極化［8］。推測HMGB-1 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1 轉(zhuǎn)化可能是急性肺損傷的治療靶點(diǎn)。

黃芩作為一味傳統(tǒng)中藥，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，其以根入藥，味苦、性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血和安胎等功效。主治溫?zé)岵　⑸虾粑栏腥尽⒎螣峥人浴駸狳S膽、肺炎、痢疾和咳血等癥［23］。而黃芩苷作為從黃芩中分離得到的主要活性成分而受到關(guān)注，已有許多關(guān)于黃芩苷的研究。有報(bào)道黃芩苷對內(nèi)毒素相關(guān)的多組織損傷具有治療作用，包括心肌功能障礙［24］，還可以通過抑制細(xì)胞炎癥因子表達(dá)在神經(jīng)退行性疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［25-26］，對LPS 引起的腎炎也有治療作用［27］。黃芩苷可以降低血管平滑肌細(xì)胞的 HMGB-1 表達(dá)［28］，降低神經(jīng)元細(xì)胞HMGB-1 和炎癥因子表達(dá)發(fā)揮抗抑郁作用［29］。這些發(fā)現(xiàn)表明黃芩苷是炎癥疾病的潛在治療藥物，并且很可能通過抑制HMGB-1 發(fā)揮抗炎作用，為了驗(yàn)證黃芩苷治療急性肺損傷的機(jī)制，我們用人巨噬細(xì)胞系U937 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。巨噬細(xì)胞M1 表型為促炎表型，特征為炎癥因子表達(dá)上升，如TNF-α、IL-1β和 IL-12 p70［30-31］。CD86 作為巨噬細(xì)胞 M1 表型的標(biāo)志物，可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD86的表達(dá)來驗(yàn)證細(xì)胞表型［32］。使用Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)檢測M1 標(biāo)志物的結(jié)果顯示，黃芩苷可以抑制LPS 引起的巨噬細(xì)胞向M1 表型極化，并降低其誘導(dǎo)的HMGB-1 蛋白水平升高。表明炎癥模型下HMGB-1表達(dá)增加且巨噬細(xì)胞向M1極化，而黃芩苷可以抑制這些現(xiàn)象起到保護(hù)作用，說明黃芩苷的抗肺損傷作用與其相關(guān)。在炎癥模型下，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性下降，而加入黃芩苷可以防止這一效果。并且使用HMGB-1 中和抗體時(shí)，可以達(dá)到和黃芩苷類似的效果，說明黃芩苷是通過HMGB-1 來抑制巨噬細(xì)胞向M1 表型轉(zhuǎn)化的。總之，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明黃芩苷通過抑制HMGB-1 抑制巨噬細(xì)胞向M1 轉(zhuǎn)化，并且有細(xì)胞保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷灌胃的小鼠的肺泡灌洗液中的HMGB-1 和M1 表型標(biāo)志物，也是炎癥因子的IL-1β 和TNF-α 表達(dá)相對于模型組顯著減少，在體驗(yàn)證黃芩苷通過抑制HMGB-1 抑制巨噬細(xì)胞M1 表型的作用，肺濕干重比的結(jié)果也表明黃芩苷對LPS造成的肺水腫有明顯保護(hù)作用。表明黃芩苷可以抑制LPS 造模帶來的HMGB-1 升高和巨噬細(xì)胞M1 表型，減少肺組織水腫，從而發(fā)揮抗急性肺損傷的作用。

盡管急性肺損傷的發(fā)病率仍然很高，但近20 年來對其病理生理學(xué)的研究已使死亡率大幅降低。目前治療的重點(diǎn)是通過呼吸機(jī)和藥物干預(yù)如糖皮質(zhì)激素來限制其進(jìn)展，這些措施可以減少在肺內(nèi)皮和上皮屏障處出現(xiàn)的炎癥。但現(xiàn)有的治療藥物仍有缺陷，除機(jī)械呼吸外，需要更安全副作用小的藥物治療急性肺損傷。因此，開發(fā)一種更安全有效的急性肺損傷治療方法是緊迫而重要的［17］。本文對治療急性肺損傷的藥物研發(fā)和選取提供了新思路，為黃芩苷作為急性肺損傷和其他炎性疾病的藥物提供研究基礎(chǔ)。