大黃素通過調(diào)控ROS/TXNIP/NLRP3軸介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑減輕重癥肺炎大鼠肺損傷*

王亞靜， 張 靜， 宋衛(wèi)衛(wèi)， 高延秋

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 1呼吸康復(fù)科，2呼吸重癥科，河南鄭州450006）

肺炎是威脅人類健康的重要疾病之一，主要是由細(xì)菌、病毒等病原體引起肺部感染造成，肺炎的嚴(yán)重程度取決于肺部炎癥程度、肺部炎癥的擴(kuò)散程度等，出現(xiàn)嚴(yán)重低氧血癥、急性呼吸衰竭、低血壓和休克等不良表現(xiàn)即可認(rèn)定為重癥肺炎，重癥肺炎時(shí)肺組織產(chǎn)生大量炎癥因子，機(jī)體炎癥反應(yīng)過度激活，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，因此尋找具有抗炎作用的藥物對于緩解重癥肺炎具有積極作用［1-2］。大黃素是中藥大黃的干燥根和莖中有效活性成分之一，具有抗炎、止血、降血脂和抗氧化等多種生物活性［3］。Dai 等［4］的研究顯示大黃素可顯著提高甲型流感病毒肺炎小鼠的存活率，減輕肺水腫程度，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對小鼠的肺組織具有一定的保護(hù)作用。但關(guān)于其可能的機(jī)制報(bào)道卻較少。資料顯示，急性肺損傷可導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過度產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的表達(dá)，TXNIP 參與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)炎性因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［5-6］。Meng 等［7］證實(shí)，洋地黃黃酮對于緩解脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有積極作用，并認(rèn)為它可能是通過減少機(jī)體ROS 產(chǎn)生、抑制NLRP3 炎癥小體的激活而發(fā)揮作用的。因此，本項(xiàng)工作在前人研究的基礎(chǔ)上探究大黃素對重癥肺炎大鼠肺損傷的影響是否與ROS/TXNIP/NLRP3 通路相關(guān)，以期為重癥肺炎的治療提供參考資料。

材料和方法

1 動物

40只SD 雄性大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司），SPF級，8周齡，體質(zhì)量230～260 g，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0011。所有大鼠在干凈整潔的環(huán)境中飼養(yǎng)，12 h 晝夜交替，自由飲食、飲水，溫度約25 ℃，相對濕度約50%，定時(shí)清潔鼠籠。在實(shí)驗(yàn)過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

2 主要試劑

ROS 激活劑氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide，TMAO）和大黃素購于陶素生化；HE 染色試劑盒、高效RIPA 裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β ELISA 試劑盒及ROS 檢測試劑盒購于上海碧云天公司；兔源TXNIP、NLRP3、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）、caspase-1 和 GAPDH Ⅰ抗及羊抗兔IgG Ⅱ抗購于Abcam。G-100 血?dú)夥治鰞x（深圳市西爾曼科技有限公司）；XElx800 酶標(biāo)儀（PerkinElmer）；Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；GIS-500凝膠成像儀（Miulab）。

3 主要方法

3.1 動物模型制備及分組給藥 重癥肺炎大鼠模型的構(gòu)建參考文獻(xiàn)［8］方法制備，將肺炎克雷伯桿菌濃度調(diào)整為1.5×1012CFU/L，將大鼠用2%的戊巴比妥鈉麻醉后固定，常規(guī)消毒后切開頸部皮膚，使氣管暴露，用注射器將0.15 mL 的肺炎克雷伯桿菌液由氣管滴入，將大鼠保持直立位20 s 以保證菌液進(jìn)入肺部，當(dāng)觀察到大鼠呼吸急促、呆滯、反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥時(shí)（SaO2＜90%）認(rèn)為重癥肺炎模型構(gòu)建成功。40 只SD 大鼠隨機(jī)分為對照（control）組、模型（model）組、大黃素（emodin）組［9］、TMAO 組［10］和emodin+TMAO 組，每組8 只，除對照組外其余各組均構(gòu)建大鼠重癥肺炎模型，對照組以生理鹽水替代菌液，其余操作均相同。大黃素組大鼠每天灌胃80 mg/kg 大黃素，TMAO 組大鼠每天灌胃110 mg/kg TMAO 溶液，大黃素+TMAO 組大鼠每天灌胃80 mg/kg 大黃素后再灌胃110 mg/kg TMAO 溶液，持續(xù)灌胃2周，對照組和模型組以生理鹽水替代。

3.2 大鼠動脈血?dú)夥治?末次灌胃結(jié)束后24 h，將大鼠麻醉后采用肝素抗凝管取血1 mL，用全自動血?dú)夥治鰞x分析各組大鼠動脈血二氧化碳（carbon dioxide，CO2）含量、動脈 CO2分壓（arterial CO2partial pressure，PaCO2）、動脈血氧飽和度（arterial blood oxygen saturation，SaO2）和動脈氧分壓（arterial oxygen partial pressure，PaO2）。

3.3 大鼠肺泡灌洗液和肺臟組織的采集 將大鼠麻醉處死，胸部皮膚常規(guī)消毒，剪開胸部皮膚暴露胸腔，結(jié)扎大鼠右側(cè)支氣管，將磷酸鹽緩沖液由左側(cè)主氣管注入左側(cè)肺泡，觀察到大鼠肺部膨隆后抽回緩沖液，反復(fù)沖洗 3 次，合并緩沖液，250×g離心 10 min，上清液用于炎癥因子水平的測定，沉淀物用于炎癥細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)。取大鼠右側(cè)肺組織，一部分用于HE 染色，一部分用于ROS/TXNIP/NLRP3 通路相關(guān)指標(biāo)的測定。

3.4 大鼠肺組織HE 染色觀察 取適量大鼠肺組織，于4%甲醛溶液中固定48 h，采用自動組織脫水機(jī)將肺組織進(jìn)行脫水、透明處理，常規(guī)石蠟包埋并切成4 μm 厚的薄片，貼附在載玻片上，參考HE 染色試劑盒的要求進(jìn)行操作，主要包括脫蠟至水、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、封片等操作，于顯微鏡下觀察并分析。

3.5 大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子及炎癥細(xì)胞測定 取大鼠肺泡灌洗液上清，用ELISA試劑盒檢測其中TNF-α、IL-6及IL-1β水平，具體操作按照相關(guān)試劑盒的說明書進(jìn)行。取大鼠肺泡灌洗液沉淀物，用生理鹽水重懸后均勻涂抹于載玻片中央，干燥后用瑞氏染液染色3 min，水洗，干燥后用中性樹膠進(jìn)行封片，于顯微鏡下選取200個(gè)白細(xì)胞，由經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測人員統(tǒng)計(jì)其中嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等各類白細(xì)胞的數(shù)目。

3.6 大鼠肺組織ROS/TXNIP/NLRP3 通路相關(guān)指標(biāo)檢測 取大鼠肺組織，剪碎后制成組織勻漿，采用ROS 試劑盒測定其中ROS 活性，具體操作參考相關(guān)試劑盒的要求進(jìn)行。取剩余大鼠肺組織，剪碎后加入高效RIPA 裂解液提取總蛋白，用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)含量，將蛋白樣品用蛋白上樣液調(diào)成相同濃度，高溫加熱至蛋白變性，SDS-PAGE 分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，于5%脫脂奶粉溶液中封閉處理，加入兔源TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1 和 GAPDH Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，用TBST 緩沖液沖洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST 緩沖液沖洗后顯色、定影，于凝膠成像儀中觀察、拍照并分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠動脈血?dú)夥治銮闆r

與對照組相比，模型組大鼠PaCO2顯著升高（P＜0.05），CO2含量、PaO2和SaO2顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，大黃素組大鼠PaCO2顯著降低（P＜0.05），CO2含量、PaO2和SaO2顯著升高（P＜0.05）；模型組與TMAO 組相比上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與大黃素組相比，emodin+TMAO 組大鼠PaCO2顯著升高（P＜0.05），CO2含量、PaO2和 SaO2顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血?dú)夥治鲋笜?biāo)比較Table 1.Comparison of blood gas analysis of the rats in each group（Mean±SD. n=8）

2 各組大鼠肺組織HE染色觀察

對照組大鼠肺組織無明顯病變，結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肺組織損傷較嚴(yán)重，存在炎癥細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)增厚、肺泡萎陷等現(xiàn)象；與模型組相比，大黃素組大鼠肺組織受損得到一定恢復(fù)，模型組與TMAO 組肺組織病理表現(xiàn)相當(dāng)；與大黃素組相比，emodin+TMAO組大鼠肺組織恢復(fù)效果較差。見圖1。

Figure 1.HE staining of lung tissue in each group.Red arrows indicated alveolar collapse；yellow arrows indicated inflammatory cell infiltration；blue arrows indicated thickening of lung interstitium.The scale bar=100 μm.圖1 各組大鼠肺組織HE染色圖片

3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

與對照組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，大黃素組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05）；模型組與TMAO 組相比，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與大黃素組相比，emodin+TMAO 組大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較Table 2.Comparison of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of the rats in each group（ng/L.Mean±SD. n=8）

4 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的分類比較

與對照組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液中EOS、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，大黃素組大鼠肺泡灌洗液中EOS、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著降低（P＜0.05）；模型組與TMAO組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與大黃素組相比，emodin+TMAO 組大鼠肺泡灌洗液中EOS、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞比較Table 3.Comparison of inflammatory cells in alveolar lavage fluid of the rats in each group（×106/L.Mean±SD. n=8）

5 各組大鼠肺組織ROS/TXNIP/NLRP3 通路相關(guān)指標(biāo)的比較

與對照組相比，模型組大鼠肺組織中ROS 活性及 TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，大黃素組大鼠肺組織中ROS 活性及 TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；模型組與TMAO 組相比上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與大黃素組相比，emodin+TMAO 組大鼠肺組織中ROS 活性及TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見表4及圖2。

表4 各組大鼠肺組織ROS活性及ROS/TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的情況Table 4.ROS activity and ROS/TXNIP/NLRP3 pathway-related protein expression in lung tissues of the rats in each group（Mean±SD. n=8）

Figure 2.Expression of ROS/TXNIP/NLRP3 signaling pathwayrelated proteins in the rats of each group.圖2 各組大鼠ROS/TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

討 論

肺炎是由微生物、多種理化因素等造成的肺泡、肺間質(zhì)炎癥性疾病，常見的為細(xì)菌性肺炎。重癥肺炎患者機(jī)體炎癥反應(yīng)程度、肺部炎癥擴(kuò)散程度較高，有嚴(yán)重低氧血癥、低血壓、急性呼吸衰竭等不良表現(xiàn)，具有較高的病死率［11-12］。肺炎克雷伯桿菌是一種革蘭氏陰性菌，是常見的毒性較強(qiáng)的病原菌之一，本研究通過氣管滴入肺炎克雷伯桿菌構(gòu)建大鼠重癥肺炎模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠動脈血PaCO2值顯著高于正常組大鼠，動脈血CO2含量、PaO2和SaO2值顯著低于正常組大鼠，HE 染色結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織損傷較嚴(yán)重，存在炎性細(xì)胞浸潤、肺泡萎縮，肺間質(zhì)增厚等現(xiàn)象，肺泡灌洗液中炎性因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）及炎性細(xì)胞顯著增多，提示肺炎克雷伯桿菌可造成大鼠肺部炎癥反應(yīng)加劇，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重低氧血癥，表明大鼠重癥肺炎模型構(gòu)建成功。

重癥肺炎與肺部炎癥反應(yīng)聯(lián)系密切，大黃素是蒽醌類衍生物，是植物大黃根莖中的有效活性成分之一，具有抗炎、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗糖尿病和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，對于急性胰腺炎、哮喘、牙周炎、脂肪肝、糖尿病等疾病有潛在的治療價(jià)值［13-14］，資料顯示大黃素具有廣譜抗菌、抗病毒的藥理作用，主要通過抑制病毒的吸附、穿入過程抑制病毒復(fù)制，用于治療新型冠狀病毒肺炎具有一定的可能性［15］。Pang等［16］研究顯示大黃素可通過降低TNF-α 和IL-1β 等炎癥因子水平、抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑減輕二氧化硅引起的肺損傷及肺纖維化，謝璟等［17］研究表明大黃素可顯著降低肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織炎癥反應(yīng)，降低小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎癥因子水平，進(jìn)而減輕肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過大黃素處理的重癥肺炎大鼠動脈血PaCO2、肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平、炎癥細(xì)胞數(shù)量及 ROS活性顯著降低，動脈血CO2含量、PaO2和SaO2顯著升高，肺組織損傷減輕，提示大黃素可顯著改善重癥肺炎大鼠的嚴(yán)重低氧血癥，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，對重癥肺炎大鼠損傷肺組織具有一定的保護(hù)作用。

多項(xiàng)研究表明ROS/TXNIP/NLRP3 通路與焦亡及炎癥反應(yīng)聯(lián)系密切，肺炎克雷伯桿菌可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，ROS 的過度產(chǎn)生可促進(jìn)TXNIP 的表達(dá)，TXNIP 參與NLRP3 炎癥小體的激活及促炎因子的成熟和分泌，NLRP3 炎癥小體信號是一類大分子多蛋白復(fù)合體，由 NLRP3、ASC 和 caspase-1 組成，可識別機(jī)體危險(xiǎn)信號，激活的NLRP3 可通過ASC 招募caspase-1，促進(jìn)其水解形成有活性的caspase-1，典型的焦亡是由有活性的caspase-1 介導(dǎo)的，caspase-1可促進(jìn)IL-1β 等炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)，引起組織、細(xì)胞的焦亡［18-19］。Jiang 等［20］研究發(fā)現(xiàn)脂多糖可引起小鼠肺組織炎癥反應(yīng)加劇，引發(fā)肺損傷，導(dǎo)致肺組織中 ROS 活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達(dá)增加，Han 等［21］研究發(fā)現(xiàn)抑制機(jī)體ROS 活性、下調(diào)肺組織中TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達(dá)對于緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷具有一定的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中 ROS 活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1蛋白表達(dá)顯著高于正常大鼠，經(jīng)過大黃素治療后大鼠肺組織炎癥及損傷得到緩解，肺組織中ROS活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達(dá)顯著降低，ROS 激活劑TMAO 單獨(dú)處理與模型組大鼠各指標(biāo)差異不顯著，提示模型大鼠體內(nèi)ROS/TXNIP/NLRP3 通路可能已處于充分激活狀態(tài)，但是大黃素和ROS 激活劑TMAO 聯(lián)合處理與大黃素單獨(dú)處理相比，大鼠肺組織炎癥及損傷加重且ROS 活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達(dá)顯著升高，提示大黃素緩解重癥肺炎大鼠肺損傷的作用可能與抑制ROS/TXNIP/NLRP3通路有關(guān)。

綜上所述，大黃素可緩解重癥肺炎大鼠的肺部炎癥及肺損傷，可能與抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有關(guān)，而大黃素作用機(jī)制復(fù)雜，是否亦通過其他途徑發(fā)揮作用仍不清晰，故而后續(xù)需更深入的研究。