脂聯素抑制甲基環糊精包被的膽固醇誘導的人血管平滑肌細胞泡沫化*

薛貽敏， 孟 春， 曾麗娟， 黃廷烽， 吳 畏， 林風輝△

（1福建醫科大學省立臨床醫學院，福建省立醫院重癥醫學四科，福建福州350001；2福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的首要原因，后期斑塊區域破裂形成的血栓可導致急性供血障礙甚至死亡。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）源性泡沫細胞大量存在于AS 斑塊病變區域內，是主要的泡沫細胞之一，它們通過自分泌細胞因子并促進自身的增殖、遷移和炎癥反應，在AS 斑塊重塑及失穩過程中發揮重要作用［1-2］。脂聯素（adiponectin，APN）是脂肪細胞分泌的一種內源性蛋白質，具有調節脂質代謝、降低炎癥反應、減輕胰島素抵抗、穩定血管斑塊等多種生物學效應，在AS 相關的多種心血管疾病中起保護作用［3］，但其具體作用機制仍未被完全闡明。本研究用甲基環糊精包被的膽固醇（cholesterol：methyl-βcyclodextrin，Chol：MβCD）誘導體外培養的 VSMCs源性泡沫細胞，并基于沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/過氧化物酶增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisomal proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）通路探討APN 對 VSMCs 泡沫化的影響，尋找 APN 抗 AS 的潛在機制。

材料和方法

1 主要試劑

人主動脈平滑肌細胞株（CRL-1999）購自ATCC。人重組 APN、Chol：MβCD 及油紅 O 染料均購自 Sigma；膽固醇檢測試劑盒及熒光標記膽固醇外流分析試劑盒均購自BioVision；胎牛血清購自Gibco。硫酸鏈霉素和青霉素均購自華北制藥股份公司；DMEM低糖培養液及TRIzol 試劑購自Invitrogen；BCA 蛋白濃度測驗盒購自上海碧云天生物工程有限公司；逆轉錄酶試劑盒購自TaKaRa；RT-qPCR 試劑盒購自Roche；PCR 引物由上海生工生物技術有限公司設計合成；兔抗 SIRT1、PGC-1α 和 GAPDH 抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1 VSMCs 的培養 用DMEM 低糖培養液（加入10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素）培養人主動脈平滑肌細胞，于恒溫細胞培養箱（37 ℃、5%CO2）內培養。每2～3 d更換一次培養液，實驗選取對數期增殖旺盛的細胞。

2.2 實驗分組 以每孔 1×105接種 VSMCs 至 24 孔板上，細胞貼壁后更換為無血清培養液培養24 h。將細胞分為5 組：對照組（正常培養）、泡沫細胞組（加入含有100 mg/L Chol：MβCD 的DMEM 低糖培養液，繼續刺激 24 h 構建 VSMCs 源性泡沫細胞模型［4］）及低、中、高劑量APN 組（在泡沫細胞構建成功后分別加入2.5、5 和 10 mg/L APN 繼續干預24 h，其余兩組給予同等體積的 PBS 干預 24 h［5］）。每組設 3 個復孔。

2.3 油紅O 染色 油紅O 染料0.7 g溶于200 mL 異丙醇中制成油紅O 儲存液，稀釋2/3 后配成工作液。培養結束后，倒去培養液，PBS 沖洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，室溫放置10 min 后加入油紅O 工作液，避光染色30 min，顯微鏡下觀察細胞形態，對紅染顆粒計數，計算單個細胞內平均脂質含量。

2.4 酶熒光化學法檢測細胞內膽固醇含量 離心管收集細胞，PBS 洗脫后加入 500 μL 正己烷/異丙醇混合液，超聲破碎細胞，以800×g離心10 min，收集上清液，按照膽固醇測定試劑盒說明書，測定胞內總膽固醇（total cholesterol，TC）和游離膽固醇（free cholesterol，FC），以mg/（g protein）表示。膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）=TC-FC。CE/TC×100%＞50%則認為符合泡沫細胞改變。

2.5 膽固醇流出率的檢測 按照熒光檢測試劑盒說明書檢測細胞膽固醇流出率，計算方法：膽固醇流出率（%）=細胞上清液熒光測值/（細胞上清液熒光測值+細胞裂解液熒光測值）×100%。

2.6 RT-qPCR 檢測 各 組細 胞 SIRT1 和 PGC-1α 的mRNA 表達 各組細胞用 PBS 清洗 2 次，TRIzol 試劑提取總RNA 后，按逆轉錄酶試劑盒及RT-qPCR 試劑盒說明書進行RT-qPCR 檢測。反應參數為：95.0 ℃5 min預變性；95.0 ℃ 15 s變性，60 ℃ 30s退火，循環40 次。各樣本重復3 次，以β-肌動蛋白（actin）為內參照，各基因的相對表達量均采用2-ΔΔCt法表示。所用引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測各 組 細胞 SIRT1 和 PGC-1α的蛋白表達 提取各組細胞總蛋白并進行蛋白定量（BCA 法），取等量蛋白（30 μg）行SDS-PAGE 分離后轉移至聚偏氟乙烯膜上，非特異性封閉2 h，加入Ⅰ抗（兔抗 SIRT1 和 PGC-1α 抗體 1∶500 稀釋，兔抗GAPDH 抗體 1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，HRP 標記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000 稀釋）室溫孵育1 h 后ECL 顯色，凝膠圖形分析系統Image Lab 3.0 采集掃描，以 SIRT1、PGC-1α 與 GAPDH 條帶灰度值的比值表示其相對表達量。

3 統計學處理

使用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組細胞油紅O染色結果

對照組的VSMCs呈梭形，胞內幾乎無紅色顆粒，生長過程呈典型峰谷狀；泡沫細胞組VSMCs 形態增大變圓，胞質大量紅色脂滴聚集，胞內脂質含量顯著升高（P＜0.05），呈泡沫樣改變；與泡沫細胞組比較，低、中和高劑量APN 干預組VSMCs 胞內脂質含量均顯著下降（P＜0.05），泡沫細胞減少；隨著APN 濃度的增加，細胞內紅色顆粒呈下降趨勢，見圖1。

Figure 1.Results of oil red O staining in each group（scale bar=50 μm）.A：control group；B：foam cell group；C：low-dose（2.5 mg/L）APN group；D：middle-dose（5 mg/L）APN group；E：high-dose（10 mg/L）APN group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs A；#P＜0.05 vs B；?P＜0.05 vs C.圖1 各組細胞油紅O染色結果

2 各組細胞胞內膽固醇檢測結果

與對照組相比，泡沫細胞組胞內TC、FC 和CE 的含量及CE/TC 值均顯著升高（P＜0.05）；各APN 干預組中，胞內TC 和CE 含量及CE/TC 值均較泡沫細胞組顯著下降（P＜0.05）；高劑量APN 降低CE 和CE/TC的效果優于中、低劑量APN（P＜0.05），見表2。

表2 各組細胞胞內膽固醇檢測結果檢測Table 2.The levels of intracellular cholesterol in each group（Mean±SD. n=3）

3 各組細胞膽固醇流出率檢測結果

與對照組相比，泡沫細胞組細胞膽固醇流出率顯著升高（P＜0.05）；各劑量APN 干預后，細胞膽固醇流出率均較泡沫細胞組顯著升高（P＜0.05）；不同劑量組間比較結果顯示，中、高劑量APN 組細胞膽固醇流出率顯著高于低劑量 APN 組（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Cholesterol efflux in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs foam cell group；?P＜0.05 vs low-dose APN group.圖2 各組細胞膽固醇流出率檢測結果

4 各組細胞SIRT1和PGC-1α的mRNA表達

與對照組比較，泡沫細胞組SIRT1 和PGC-1α 的mRNA 相對表達量均顯著下降（P＜0.05）；各APN 干預組中，SIRT1 和 PGC-1α 的 mRNA 相對表達量均較泡沫細胞組顯著升高（P＜0.05）；中、高劑量APN 組SIRT1和PGC-1α的mRNA相對表達量顯著高于低劑量APN組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The mRNA levels of SIRT1（A）and PGC-1α（B）in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs foam cell group；?P＜0.05 vs low-dose APN group圖3 各組細胞SIRT1和PGC-1α的mRNA表達

5 各組細胞SIRT1和PGC-1α的蛋白表達

與對照組比較，泡沫細胞組SIRT1 和PGC-1α 蛋白的相對表達量均顯著下降（P＜0.05）；各APN 干預組中，SIRT1 和PGC-1α 蛋白的相對表達量均較泡沫細胞組顯著升高（P＜0.05）；中、高劑量APN 組SIRT1和PGC-1α 蛋白的相對表達量顯著高于低劑量APN組（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.The protein levels of SIRT1（A）and PGC-1α（B）in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs foam cell group；?P＜0.05 vs low-dose APN group.圖4 各組細胞SIRT1和PGC-1α蛋白的表達

討 論

VSMCs攝取大量脂質成分使得細胞外觀呈現泡沫樣改變是AS 病變過程的中心環節。體外實驗中膽固醇因不溶于水難以被細胞直接吸收，β-環糊精具有外側親水、內側疏水的環狀立體結構，性質穩定，可吸附膽固醇而形成緊密的包合物。Chol：MβCD 作為膽固醇和β-環糊精的包合物，可順利進入細胞中并釋放出膽固醇，造成胞內膽固醇蓄積，從而建立穩定的泡沫細胞模型［6］。故本研究利用Chol：MβCD 刺激VSMCs，誘導VSMCs 源性泡沫細胞模型，模擬人體內AS 病變過程中膽固醇沉積和泡沫細胞的形成。目前認為，在中晚期AS 斑塊病變中，絕大多數泡沫細胞為VSMCs 源性，抑制VSMCs 泡沫化有助于穩定斑塊、延緩AS 進程。APN 是維持血管穩態的重要因子，可通過與其受體結合，抑制脂質合成，促進脂肪酸氧化，從而調控脂質平衡［7］。本研究使用不同濃度APN 干預VSMCs 源性泡沫細胞，結果顯示APN 可呈濃度依賴性抑制VSMCs 的脂質沉積，促進細胞膽固醇流出，提示APN 可有效抑制Chol：MβCD誘導的人VSMCs泡沫化。

膽固醇在細胞內以FC 及CE 兩種形式存在，二者存在著動態平衡，酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶是調控胞內膽固醇代謝平衡的關鍵酶，可將多余的FC 轉化為CE 并儲存于細胞內的脂滴中，從而避免過量的FC 對細胞造成損傷，減少CE 在胞內的沉積是抑制泡沫細胞形成的關鍵［8］。本研究中APN 可顯著降低細胞內TC，隨著劑量的增加對胞內CE 的抑制更加顯著，從而降低CE/TC，促進細胞膽固醇流出，說明APN 主要通過抑制CE 沉積抑制細胞泡沫化。此外，Ebrahimi-Mamaeghani 等［9］的研究證實，APN 可通過抑制血小板聚集，減少血小板活化，發揮一定的抗血栓作用；Wang 等［10］的研究顯示，抑制APN 的表達可使內皮依賴性平滑肌松弛障礙加重，從而進一步損害血管內皮細胞。以上研究說明APN可通過多種途徑發揮抗AS作用。

SIRT1 是sirtuin 家族成員之一，可通過對底物的去乙酰化作用參與細胞的分化、增殖、凋亡和代謝等過程。已有研究表明，VSMCs中SIRT1的表達減少可促進AS中斑塊纖維帽的破裂，SIRT1還可通過抑制核因子κB信號通路而抑制VSMCs泡沫化［11-12］。PGC-1α是SIRT1的靶分子，SIRT1對PGC-1α的去乙酰化能顯著提高PGC-1α 的活性；作為眾多轉錄因子的共激活因子，PGC-1α 能通過抑制活性氧自由基介導的VSMCs遷移及增殖，減少泡沫細胞的形成［13-14］。本研究中VSMCs 源性泡沫細胞的形成伴隨著SIRT1 和PGC-1α 的表達降低，提示 SIRT1/PGC-1α 通路參與VSMCs的泡沫化進程，這與上述文獻研究一致。近年研究顯示APN 可通過干擾Toll 樣受體4 介導的炎癥反應抑制 VSMCs 泡沫化［15］，另外蛋白激酶 C/活化蛋白激酶C受體1也可能是APN 抑制VSMCs泡沫化的作用通路［5］，然而 APN 是否通過調控 SIRT1/PGC-1α通路影響VSMCs泡沫化還未見報道。本研究結果顯示，APN 可以逆轉VSMCs 源性泡沫細胞中SIRT1 和PGC-1α的低表達，促進細胞膽固醇流出，減輕胞內脂質沉積，說明APN 可能通過SIRT1/PGC-1α 通路抑制VSMCs泡沫化。既往在成肌細胞中，有研究證實APN可通過誘導胞外Ca2+內流，激活腺苷酸活化蛋白激酶信號來調控SIRT1/PGC-1α通路［16］。本研究中APN對SIRT1/PGC-1α通路的調控機制仍有待進一步闡明。

綜上所述，本研究結果表明APN 在體外可呈濃度依賴性抑制Chol：MβCD 誘導的人VSMCs 泡沫化，并可能通過調控SIRT1/PGC-1α 通路來實現，為進一步探討APN的抗AS作用奠定了實驗基礎。