木霉P3.9菌株對枇杷根際細菌多樣性及其群落組成的影響

魯海菊，李曉靜，馮 渝，沈云玫，陶宏征

(紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自，661199)

枇杷內生木霉TrichodermaatrovirideP3.9菌株抗菌譜廣[1]，發酵工藝簡單[2-3]，可抑制枇杷根腐病菌[4]，并能成功定殖于枇杷根際[5]及其植株內[6]，且抑制枇杷根際土壤真菌[7]及枇杷內生真菌[8]，促進枇杷根際細菌生長[9]，對枇杷植株有促生防病作用，具有廣闊的開發應用前景。

隨著高通量技術的發展，甜瓜[10]、丹參[11-12]、桑樹[13]、麻山藥[14]、胡蘿卜[15]、白樺[16]、苜蓿[17]、西洋參[18]、紅花[19]、水稻和小麥[20]、櫻桃[21]、駱駝蓬[22]、枸杞[23]、大花杓蘭[24]根際土壤細菌群落多樣性得以揭示；辣椒健康植株與枯萎病株[25]、西洋參健康植株與西洋參根腐病病株[26]根際土壤細菌多樣性差異性得以明確。陸續有報道碳[27]、氮[28]、生物炭[29-31]、秸稈[32-35]、木醋液[10]、除草劑使它隆[36-37]、生防菌[38]添加對農田土壤細菌群落的影響，發現土壤添加木醋液[10]、生物炭[27，29-30]、生防細菌[38-39]能增加細菌多樣性，除草劑使它隆[36-37]能降低土壤細菌多樣性。為了明確木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤細菌多樣性及群落結構的影響，揭示其對枇杷植株的促生防病機理，本文采用高通量測序技術，分析添加木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤細菌多樣性及群落結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為內生木霉P3.9菌株Trichodermaatroviride，保存于紅河學院植物病理學標本室。PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖17 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌懸液接種根際土壤的方法 將P3.9菌株在PDA平板上28 ℃培養5 d，加無菌水用粉碎機攪拌均勻，制成孢子菌懸液1×106cfu/mL，將其灌根于苗齡1年的枇杷盆栽嫁接苗，每株500 mL；灌根等量清水做為對照，重復3次，常規肥水管理。

1.2.2 枇杷根際土樣采集 兩個灌根處理第10、20、30、40、50、60、70、80、90天，用土鉆5點取樣法隨機采集深度5～20 cm的根際土樣，過200目篩，用四分法混勻備用。

1.2.3 枇杷根際土壤總DNA提取 用Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒按照說明提取。

1.2.4 設計并合成引物接頭 根據illumina Miseq高通量測序要求，進行雙向測序，設計目標區域和帶有5′Miseq接頭-barcode-測序引物-特異引物-3′的融合引物。

F：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3′，R：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特異引物-3′。

1.2.5 PCR擴增和產物純化定量及均一化 用微基生物科技(上海)有限公司通用流程進行。

1.2.6 MiSeq高通量測序 54個樣品送微基生物科技(上海)有限公司測序。

1.2.7 數據統計 Operational Taxonomic Units(OTU)聚類：利用UPARSE在97%相似度下進行聚類，得到OTU的代表序列；利用UCHIME將PCR擴增產生的嵌合體從OTU代表序列中去除；16S和ITS采取和已有的嵌合體數據庫進行比對的方法去除嵌合體。16S嵌合體數據庫為gold database(v20110519)，ITS嵌合體數據庫為UNITE(v20140703)，分為ITS全長、ITS1和ITS2，按測序區域進行選擇。使用usearch_global方法將所有序列比對回OTU代表序列，得到每個樣品在每個OTU的豐度統計表。通過mothur(classify.seqs)軟件將OTU代表序列與數據庫比對進行物種注釋，置信度閾值設置為0.8。使用軟件USEARCH和mothur去除沒有注釋結果的OTU，去除注釋結果不屬于分析項目中的物種。

群落結構組成柱狀圖：基于每個樣品在每個OTU的豐度統計表，利用R語言工具作圖。

anova_oneway組間差異比較：選擇p<0.05的物種繪制柱形圖，每個柱子為差異物種的相對豐度，誤差線為標準誤，其中*代表0.01

Beta多樣性分析組間差異比較：基于Unifrac分析得到的距離矩陣，通過層次聚類(Hierarchical cluatering)中的非加權組平均法UPGMA 構建進化樹，分析添加木霉P3.9菌株處理與未添加對照枇杷根際細菌進化上的相似性及差異性。

2 結果與分析

2.1 對根際土壤細菌多樣性及群落豐度的影響

由表1可知，10～90 d期間，木霉P3.9菌株灌根處理的枇杷根際土壤細菌Shannon和Simpson指數與對照(清水)差異不顯著；除了第10天外，木霉P3.9菌株灌根處理的枇杷根際土壤細菌Chao、ACE指數顯著小于對照(清水)，說明木霉P3.9菌株處理使枇杷根際細菌群落豐富度略有下降，但不影響枇杷根際土壤細菌的多樣性。

表1 木霉P3.9菌株灌根對枇杷根際土壤細菌多樣性及群落豐度的影響

2.2 對根際土壤細菌群落組成的影響

2.2.1 對根際土壤細菌群落門分類地位的影響 圖1顯示枇杷根際土壤細菌主要包括15個已知門和3個不能夠注釋到的門水平。其中，物種豐度占前5位的門依次是Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria。圖2顯示木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)枇杷根際土壤細菌在門分類水平上差異顯著，導致6個門枇杷根際土壤細菌物種豐度發生變化。其中，優勢門的物種豐度未變化，Ignavibacteriae顯著降低(0.01

注：*、**、***分別表示0.01

注：每柱從左往右依次是T1_1、T1_2、T1_3、T2_1、T2_2、T2_3、T3_1、T3_2、T3_3、T4_1、T4_2、T4_3、T5_1、T5_2、T5_3、T6_1、T6_2、T6_3、T7_1、T7_2、T7_3、T8_1、T8_2、T8_3、T9_1、T9_2、T9_3、CK1_1、CK1_2、CK1_3、CK2_1、CK2_2、CK2_3、CK3_1、CK3_2、CK3_3、CK4_1、CK4_2、CK4_3、CK5_1、CK5_2、CK5_3、CK6_1、CK6_2、CK6_3、CK7_1、CK7_2、CK7_3、CK8_1、CK8_2、CK8_3、CK9_1、CK9_2、CK9_3，分別表示木霉P3.9菌株(T)和清水(CK)灌根處理第10、20、30、40、50、60、70、80、90天的根際土樣。圖3、圖5、圖7、圖9、圖11和圖13同。

2.2.2 對根際土壤細菌群落綱分類地位的影響 圖3顯示，枇杷根際土壤細菌主要包括27個綱和1個不能夠注釋到的綱水平。其中，物種豐度占前5位的綱依次是不能夠注釋到的綱、Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria。圖4顯示木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)的枇杷根際土壤真菌在綱分類水平上差異顯著，導致枇杷根際土壤細菌12個綱物種豐度發生變化，其中，優勢綱物種豐度未變化。Chloroflexia、Acidimicrobiia、Thermomicrobia、Ignavibacteria 4個綱顯著降低(0.01

圖3 在綱水平上木霉P3.9菌株和清水灌根對枇杷根際土壤細菌群落組成的影響

圖4 在綱水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根際土壤細菌群落組成差異分析

2.2.3 對根際土壤細菌群落目分類地位的影響 圖5顯示枇杷根際土壤細菌包括41個已知目和1個不能夠注釋到的目。其中，物種豐度占前5位的目依次是不能夠注釋到的目、Propionibacteriales、Anaerolineales、Xanthomonadales、Sphingobacteriales。圖6顯示木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)的枇杷根際土壤細菌在目分類水平上差異顯著，導致枇杷根際土壤細菌27個目的物種豐度發生改變，其中，優勢目的物種豐度未發生改變。Pseudonocardiales、Micrococcales、Rhizobiales、Herpetosiphonales、Acidimicrobiales、Streptomycetales、Bradymonadales、Sphaerobacterales、Thermogemmatisporales 9個目顯著降低(0.01

圖5 在目水平上木霉P3.9菌株和清水灌根對枇杷根際土壤細菌群落組成的影響

圖6 在目水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根際土壤細菌群落組成差異分析

2.2.4 對根際土壤細菌群落科分類地位的影響 圖7顯示枇杷根際土壤細菌主要包括49個已知科和1個不能夠注釋到的科。其中，物種豐度占前5位的依次是不能夠注釋到的科、Nocardioidaceae、Anaerolineaceae、Xanthomonadaceae和Planctomycetaceae。圖8顯示木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)的枇杷根際土壤細菌在科分類水平上差異顯著，導致枇杷根際土壤細菌36個科物種豐度發生改變，其中，優勢科的物種豐度未改變。Micrococcaceae、Xanthobacteraceae、Herpetosiphonaceae、Streptomycetaceae、Lamiaceae、Microbacteriaceae、Archangiaceae、Sphaerobacteraceae、Rickettsiaceae、Bacteroidaceae、Brevibacteriaceae、Oscillochloridaceae12個科顯著降低(0.01

圖7 在科水平上木霉P3.9菌株和清水灌根對枇杷根際土壤細菌群落組成的影響

圖8 在科水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根際土壤細菌群落組成差異分析

2.2.5 對根際土壤細菌群落屬分類地位的影響 圖9顯示枇杷根際土壤細菌主要包括46個已知屬和1個不能夠注釋到的屬。其中，物種豐度占前5位的依次是不能夠注釋到的屬、Aeromicrobium、Gemmatimonas、Terrimonas和Rhizobium。圖10顯示木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)的枇杷根際土壤細菌在屬分類水平上差異顯著，導致枇杷根際土壤細菌50個已知屬的物種豐度發生改變，其中優勢屬的物種豐度未改變。Nocardioides、Herpetosiphon、Allokutzneria、Pseudolabrys、Streptomyces、Lamia、Sorangium、Archangium、Agromyces、Shinella、Rubellimicrobium、Nitrolancea、Pseudaminobacter、Castellaniella和Actinocorallia15個屬顯著降低(0.01

圖9 在屬水平上木霉P3.9菌株和清水灌根對枇杷根際土壤細菌群落組成的影響

圖10 在屬水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根際土壤細菌群落組成差異分析

2.2.6 對根際土壤細菌群落種分類地位的影響 圖11顯示枇杷根際土壤細菌主要包括8個已知種，3個不能夠注釋到的種和21個未培養種，水陸兩棲細菌1種。其中，物種豐度占前5位的種均為不能夠注釋到的種或未培養種。說明土壤細菌種類極其復雜，可以進一步探索未知種。圖12顯示木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)的枇杷根際土壤細菌在種分類水平上差異顯著，導致枇杷根際土壤細菌17個已知種物種豐度發生改變。其中，Allokutzneriaalbata、Pseudaminobacterdefluvii、Streptomycesprasinus、Legionellaquinlavanii、Phytomonosporaendophytica5個種顯著降低(0.01

圖11 在種水平上木霉P3.9菌株和清水灌根對枇杷根際土壤細菌群落組成的影響

圖12 在種水平上木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根際土壤細菌群落組成差異分析

2.3 對根際細菌多樣性的持續影響

由圖13可知，調查的90 d期間，30 d之前木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)細菌多樣性聚為1大枝，50～90 d聚為另一大枝，第40天橫跨在2大枝之間。其中，第10天、第50天木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)各自聚為一小枝，20～30 d、60～70 d和80～90 d也各自聚為一小枝，第40天木霉P3.9菌株灌根處理與對照未能完全聚在同一小枝上。說明木霉P3.9菌株灌根處理30～40 d內對枇杷根際細菌多樣性有一定影響，其余時間木霉P3.9菌株灌根處理與對照(清水)的枇杷根際細菌多樣性趨于一致。

圖13 不同時間段木霉P3.9菌株和清水灌根的枇杷根際土壤細菌多樣性差異分析

3 結論與討論

試驗結果表明，枇杷根際土壤細菌優勢菌群為變形桿菌門Proteobacteria、放線菌綱Actinobacteria、丙酸桿菌目Propionibacteriales、類諾卡氏菌科Nocardioidaceae、氣微菌屬Aeromicrobium。優勢門為變形桿菌門，與甜瓜根際添加木醋液[10]、土壤添加生物炭[27，30，34-35]及添加生防細菌[38]結果一致。枇杷根際添加木霉P3.9菌株30 d之內，不改變枇杷根際細菌多樣性，30～40 d之內多樣性略有下降，50～90 d之間，枇杷根際細菌多樣性又恢復正常水平。說明枇杷根際添加木霉P3.9菌株對其根際細菌多樣性及優勢菌群種類無不良影響，反而可以改善非優勢菌群的豐度。枇杷根際添加木霉P3.9菌株致使硝化螺旋菌屬Nitrospira增加，與生物炭添加[30，38]、加氣灌溉[40]結果一致，能提高氮肥利用率[41]，與秸稈添加結果相反[33]。亞硝化螺菌屬Nitrosospira增加，與施肥[42]結果一致。亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas增加，此屬細菌是蘆葦等植物根際[43]及土壤[44]氨氧化細菌。亞硝化球菌屬Nitrosococcus增加，此屬具有將氨轉化硝酸的能力[45]。以上4個屬細菌有利于促進土壤銨態氮向硝態氮轉化[46]，能間接提高土壤肥力。金黃桿菌屬Chryseobacterium增加，此屬菌株具有Cd吸附能力[47]，修復Cd污染土壤。Micromonospora、Archangium、Nonomuraea3個屬增加，這3個屬[48-50]能產生抗生素，抑制病原菌。擬無枝酸菌屬Amycolatopsis、Smaragdicoccus、土壤紅桿菌屬Solirubrobacter、芽球菌屬Blastococcus、嗜血桿菌Azohydromonas、紅球菌屬Rhodococcus、Bauldia、諾卡氏菌屬Nocardia、帕維特桿菌屬Parviterribacter和礦生菌屬Fodinicola急劇下降。紅球菌屬Rhodococcus能引起牧草病害[51]，Legionella[52]為土壤嗜肺菌，Streptomyces[53]會引起馬鈴薯瘡痂病，這3個屬為有害細菌。其他屬在植物根際土壤中的功能尚未明確。數量發生劇烈變化的6個種在土壤中的功能尚未見報道，有待進一步研究。

綜上所述，木霉P3.9菌株灌根處理促使枇杷根際有益細菌增加，間接增強土壤肥力，對枇杷植株表現出促生[6]作用。修復Cd污染土壤，致病菌減少，防治枇杷根腐病應用前景廣闊。