山西貢梨粗多糖的提取工藝優化及其抗氧化活性研究

朱 麗，陳婉婷，白志軍，張 穎，龐杏林，袁 俊，熊 岑

(1 廣州市疾病預防控制中心，廣州，510000；2 廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東茂名，525000)

梨是我國主要水果之一，栽培歷史悠久、分布地區廣泛，山西貢梨是其中的一個主要品種。有研究證明，梨可滋肺養肺，將梨與冰糖一起熬燉食用有止咳的效果[1]。梨含B族維生素、配糖體及鞣酸等成分，能祛痰止咳，對咽喉有養護作用。梨的糖類物質和多種維生素都比較容易被人體吸收，梨有助于增進食欲。梨含有多酚類物質能夠防止動脈粥樣硬化，梨富含的果膠有助于消化通便。梨的多糖主要貯藏在果肉中。多糖的提取方法有多種，且每種方法所對應的多糖提取率也各不相同，已有研究表明，從原料中提取出來的主要是雜多糖。原料的新鮮度也會影響到多糖的提取率，所以為了保證多糖含量，必須選擇新鮮的果實。

梨的粗多糖有多種提取方法[2]，溶劑提取法，利用相似相溶的原理，合理優化提取溶劑從而達到高提取效率。李文君等[3]采用正己烷法有效將枸杞色素提取出來。酶提取法廣泛地被用于各種活性物質的提取，由于酶對相應的植物細胞的細胞壁和蛋白質有酶解的功能，為了能夠獲得更高的活性物質提取率，人們常采用酶提取法[4]。Song等[5]利用酶法α-淀粉酶、纖維素、果膠酶或蛋白酶(LLEP-PR)提取荷葉多糖。超聲提取法所需時間更短，設備簡單，節約成本，具有獨特的優勢。周恩紅等[6]利用超聲提取法來研究大別山區金櫻子多糖含量時，進行了單因素優化提取條件，同時也設計了正交試驗對多糖含量進行檢查。植物多糖提取后經過分離工藝如脫色法、分步沉淀法、鹽析法或柱層析法進行分離純化。植物多糖的含量測定有苯酚-硫酸法[7]、液相色譜法[8]。

植物多糖能夠抑制清除自由基，醫學上常利用植物多糖的抗氧化活性治療因自由基積累所造成的疾病[9-10]。粗多糖具有降血糖、防治糖尿病、降血脂、抗血凝等作用。梨作為一種常見水果，其粗多糖、黃酮、多酚等活性物質的抗氧化性研究具有醫學應用價值。植物多糖的抗氧化性研究方法有DPPH自由基清除法[11]、ABTS自由基清除法[12]、羥基自由基清除法[13]。羥基自由基的清除有鄰二氮菲法和水楊酸法兩種最為常用的方法。薛娟等[13]在對中藥黃柏多糖成分進行含量測定及抗氧化活性研究時發現，黃柏的多糖能夠有效地清除DPPH自由基和·OH，清除率均呈現出良好的量效關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗的山西貢梨購買自大型超市，采購時選擇外表完整、氣味正常、看起來成熟度適中的新鮮果實。本研究所涉及的試劑名稱、規格以及生產廠家見表1，實驗主要儀器和設備見表2。

表1 材料與試劑

表2 儀器與設備

1.2 試驗方法

1.2.1 山西貢梨多糖的提取工藝流程

葡萄糖標準曲線的繪制。采用苯酚-硫酸法測定多糖。配制好1 mg/mL葡萄糖溶液，稀釋得0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液。分別移取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8 mL的0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液于刻度試管中，用蒸餾水定容至2 mL的刻度線，再加入1.0 mL 6%苯酚和2.0 mL濃硫酸充分搖勻后靜置半小時，在485 nm處，測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

粗多糖的超聲輔助提取。將新鮮山西貢梨去皮，取約5.0 g果肉于研缽中搗碎，轉移至100 mL小燒杯加入適量蒸餾水超聲，然后離心、棄渣留液。向濾液中加入95%乙醇沉淀粗多糖，放于4 ℃的冰箱中靜置8 h以上，過濾取下層沉淀物，以8 000 r/min離心10 min。將沉淀物定容至100 mL，搖勻后放置在4 ℃的冰箱。參照苯酚-硫酸法，使用葡萄糖標準曲線的回歸方程式來計算各吸光度對應的多糖溶液濃度，最后依據下面的公式求出相對應的粗多糖溶液的得率。

(1-1)

式中，C表示粗多糖含量(g/L)；V表示提取液體積(mL)；D表示樣品溶液稀釋倍數；W表示樣品的質量(mg)。

1.2.2 單因素試驗

根據1.2.1的粗多糖超聲輔助提取步驟進行以下條件的操作。

不同提取溫度對粗多糖提取率的影響。固定單因素：料液比取1∶40(g/mL)，提取時間20 min，超聲功率120 W。在固定的單因素條件下，測定50、60、70、80、90 ℃的提取溫度對山西貢梨粗多糖提取率所帶來的不同影響。

不同提取時間對粗多糖提取率的影響。固定單因素：料液比為1∶40(g/mL)，提取溫度80 ℃，超聲功率120 W。在固定的單因素條件下，測定10、20、30、40、50 min的提取時間對山西貢梨粗多糖提取率所帶來的不同影響。

不同料液比對粗多糖提取率的影響。固定單因素：提取時間20 min，提取溫度80 ℃，超聲功率120 W。在固定的單因素條件下，測定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的料液比對山西貢梨粗多糖提取率所帶來的不同影響。

不同超聲功率對粗多糖提取率的影響。固定單因素：料液比1∶40(g/mL)，提取溫度80 ℃，提取時間20 min。在固定的單因素條件下，測定100、110、120、130、140 W的超聲功率對山西貢梨粗多糖提取率所帶來的不同影響。

1.2.3 正交試驗

通過單因素試驗的測定選出最優的單因素水平，再在其附近分別擇取兩個水平作為正交試驗的優化水平，然后在此基礎上設計出一個正交試驗。各因素與水平的排列可以參照L9(34)正交表，然后根據設定好的提取條件來進行試驗，最后對正交試驗的結果進行討論分析，選出最佳的優化提取條件。正交試驗的操作步驟根據1.2.1的粗多糖超聲輔助提取步驟。

1.2.4 山西貢梨粗多糖清除自由基試驗

山西貢梨粗多糖清除·OH的測定。依據Fenton原理，測定山西貢梨粗多糖清除·OH的清除率。預先配制好的1 mg/mL的山西貢梨粗多糖溶液分別取0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL放置在帶刻度試管中，然后再用蒸餾水定容到4 mL，充分搖勻，得到濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的粗多糖溶液。加入9 mmol/L FeSO4溶液以及9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各0.5 mL，充分搖勻后，再加入8.8 mmol/L H2O2溶液0.5 mL，將試管轉移到37 ℃的水浴槽中加熱半小時取出冷卻至室溫，在波長為510 nm處測定其吸光度Ai。同上述步驟再另取一組試管加入試劑，將8.8 mmol/L H2O2溶液0.5 mL改成加入0.5 mL的蒸餾水，測其吸光度Aoi。取一根空管為空白組，即另取一支試管將4 mL的山西貢梨粗多糖溶液用蒸餾水代替，作為空白對照，測其吸光度Ao。每組測3次取平均值。將抗壞血酸作為試驗的陽性對照組，最后再依據公式1-2計算出相應的·OH清除率：

·OH清除率(%) = [1- (Ai-Aoi)/Ao]×100%

(1-2)

山西貢梨多糖清除DPPH·的測定。DPPH·是一種比較穩定的自由基，它的有機溶液通常會顯示紫色。當遇到抗氧化劑時自由基含量會發生變化，溶液在波長517 nm處會出現最大的吸收峰。根據這一原理進行山西貢梨粗多糖抗氧化活性測定。先從預先配制好的1 mg/mL的山西貢梨粗多糖溶液分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用蒸餾水定容到2 mL，得到濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。在各試管中分別加入2.0 mL DPPH溶液(乙醇配制，濃度0.16 mmol/L)搖勻后放入25 ℃的水浴槽中15 min。在波長為510 nm處測定其吸光度Aa。同上述步驟再另取一組試管將加入2.0 mL DPPH溶液改成加入2.0 mL的蒸餾水，其對應的吸光度為Aua表示。用一根空白試管作為空白組，即將2.0 mL的山西貢梨粗多糖溶液用蒸餾水替代，并作為空白對照，測其吸光度用Au表示。每組濃度測定3次，平均值作為試驗的參考值。以抗壞血酸作為試驗的陽性對照，最后根據公式1-3計算出相應的DPPH·清除率：

DPPH·清除率(%) = [1- (Aa-Aua)/Au]×100%

(1-3)

2 結果與討論

2.1 山西貢梨粗多糖的提取與分析

2.1.1 葡萄糖標準曲線圖

由圖1可知，標準曲線的回歸方程為y=0.012 9x-0.008 1，相關系數R2= 0.999 1。y表示測試的吸光度，x表示測試中對應的葡萄糖的質量濃度(μg/mL)，在一定的范圍內，吸光度呈現出良好線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1.2 單因素試驗分析

提取溫度對山西貢梨粗多糖提取率的影響。由式1-1可知，山西貢梨粗多糖提取率與吸光度成正比。由圖2可知，溫度小于70 ℃時，隨著溫度升高，粗多糖提取率增加較快。當溫度大于70 ℃時，隨溫度增加，粗多糖提取率增加緩慢。由于溫度升高，溶液的熱效率逐漸提高，溶液中的分子運動也逐漸變得劇烈，此狀態下細胞內的粗多糖更加容易溶解出來，但溫度過高可能影響其穩定性，因此選取60、70、80 ℃作為正交試驗中提取溫度的因素水平。

圖2 提取溫度對粗多糖提取率的影響

提取時間對粗多糖提取率的影響。由圖3可知，當提取時間小于20 min時，隨著時間增加，粗多糖的提取率逐漸增加。當提取時間為20 min時，溶液中的山西貢梨粗多糖提取率達到最大值13.73%。當提取時間大于20 min時，隨著提取時間增加粗多糖提取率開始降低，可能由于加熱時間長會導致一部分的多糖被降解，致使多糖提取率下降。20 min作為單因素試驗的最佳參考時間，因此選擇10、20、30 min作為正交試驗中提取時間的因素水平。

圖3 提取時間對粗多糖提取率的影響

料液比對山西貢梨粗多糖提取率的影響。由圖4可知，料液比小于1∶20時，隨著料液比增大，粗多糖提取率也逐漸增大。料液比為1∶20時，粗多糖的提取率達到峰值10.01%。當料液比大于1∶20時，隨著料液比增加，粗多糖提取率開始降低。在適當范圍內，隨著提取溶劑的增加，目標物萃取率增大，但是增加溶劑的同時也會增加其他物質的溶解量，從而影響有效成分的提取率。當多糖的溶出量達到平衡時，過多的溶劑可能會對多糖的含量造成影響，而且還會使其他的雜質溶入到溶劑中，進而降低了粗多糖的提取率。1∶20作為單因素試驗最佳參考料液比，因此選擇1∶10、1∶20、1∶30作為正交試驗中料液比的因素水平。

圖4 料液比對粗多糖提取率的影響

超聲功率對山西貢梨粗多糖提取率的影響。由圖5可知，當超聲功率小于120 W時，隨著超聲功率的增大，山西貢梨粗多糖提取率逐漸增加。當超聲功率為120 W時，山西貢梨粗多糖的提取率達到峰值12.49%。當超聲功率大于120 W時，隨著超聲功率增加，粗多糖提取率逐步下降。可能由于超聲波破壞了細胞壁的結構，增加了粗多糖溶出量，但超聲也伴隨著機械振動，振動加快了多糖的溶解速率，從而導致粗多糖提取率降低。本研究選擇110、120 、130 W作為正交試驗中提取功率的因素水平。

圖5 超聲功率對粗多糖提取率的影響

2.2 正交試驗結果

單因素提取水平的基礎上，選擇提取溫度、提取時間、超聲功率、料液比進行正交試驗優化，以確定山西貢梨粗多糖的提取最佳工藝條件。用A、B、C、D分別表示提取溫度、提取時間、超聲功率、料液比，繪制試驗因素與水平的關系表，具體的水平選擇可見表3。參照表3的試驗因素與水平的關系可以設計出L9(34)正交試驗，具體的正交試驗因素水平以及正交試驗的各因素水平的測試結果見表4。

表3 粗多糖提取試驗因素與水平

由表4可知，提取溫度為80 ℃、提取時間為30 min、超聲功率為120 W、料液比為1∶10(g/mL)的因素水平時，山西貢梨粗多糖的提取率僅為10.08%。由極差結果R值可知，各因素水平變化對試驗結果影響由大到小為：A>B>C>D，即提取溫度>提取時間>超聲功率>料液比，其中A對應的最優水平為A1，B對應的最優水平為B2，C對應的最優水平為C2，D對應的最優水平為D2，最優的提取工藝組合為A1B2C2D2。最佳條件為試劑2號對應的粗多糖提取率最高：提取溫度為60 ℃、提取時間為20 min、超聲功率為120 W、料液比為1∶20(g/mL)的因素水平時，山西貢梨粗多糖的提取率15.43%。

表4 正交試驗因素水平及結果分析

2.3 山西貢梨粗多糖的抗氧化能力

2.3.1 ·OH清除活性研究

由圖6可知，在試驗所選的濃度范圍之內，山西貢梨粗多糖以及抗壞血酸(Vitamin C)對羥基自由基均表現出較好的清除效果。在粗多糖的濃度為1.0 mg/mL時，山西貢梨粗多糖對羥基自由基表現出最好的清除能力。抗壞血酸屬于一種比較強的抗氧化劑，在較低的濃度就能達到非常好的清除效果。在濃度同為0.2 mg/mL的情況下，抗壞血酸對羥基自由基的清除率已經高達95.7%，而此時山西貢梨粗多糖對羥基自由基的清除作用最小，只有24.7%。當將濃度統一調至1.0 mg/mL時，抗壞血酸對羥基自由基的清除作用變化比較微小，清除率為95.9%，而山西貢梨粗多糖在此濃度下，其對羥基自由基的影響變化比較顯著，清除率增大至78.6%。在較低的濃度下，抗壞血酸就能夠表現出較強的清除能力，而且作用能力比山西貢梨粗多糖的作用能力強，而山西貢梨粗多糖只有在濃度較高的情況下才能表現出較好的清除效果。該現象可能由于山西貢梨粗多糖的純度不高，抗壞血酸是經過純化提取的固體晶體，同時也屬于強氧化劑，所以在低濃度下就能起到較好的清除作用。粗多糖的·OH清除能力證明了粗多糖具有降血糖、防治糖尿病、降血脂、抗血凝等作用。

圖6 山西貢梨粗多糖對·OH清除作用

2.3.2 DPPH·自由基清除活性

由圖7可知，一定濃度范圍內，山西貢梨粗多糖及抗壞血酸對羥DPPH·均表現出良好的清除作用。抗壞血酸在較低的濃度下即表現出較好的清除率，隨著濃度增加清除效率變化緩慢，濃度為0.1 mg/mL時，它對DPPH·的清除率高達95.5%；當濃度繼續升高到0.5 mg/mL時，DPPH·清除率為95.7%。山西貢梨粗多糖濃度在0.1～0.3 mg/mL范圍內時，對DPPH·的清除率隨著粗多糖的濃度增大而增大，當濃度增至0.3 mg/mL時，對DPPH·的清除率達到峰值87.9%，當繼續增大粗多糖濃度時，粗多糖對DPPH·的清除能力出現減弱的現象，當濃度達到試驗最大濃度0.5 mg/mL時，其對應的DPPH·的清除率為87.3%。受粗多糖含量及分子空間位阻影響，抗壞血酸對DPPH·的清除能力比山西貢梨粗多糖強。

圖7 山西貢梨粗多糖對DPPH·的清除作用

3 結論與討論

本研究以單因素試驗為基礎，通過正交試驗設計優化了山西貢梨粗多糖超聲輔助提取的工藝。結果表明，超聲輔助提取山西貢梨粗多糖的提取溫度、提取時間、超聲功率以及料液比對粗多糖的提取率均表現出較為顯著的影響。提取溫度對粗多糖提取率的影響最大，其次是提取時間和超聲功率，合理的料液比對提取率的影響不明顯。經過正交試驗的條件優化，可得出山西貢梨粗多糖最佳的提取條件為：提取溫度60 ℃，提取時間為20 min，料液比1∶20(mg/mL)，超聲功率120 W，山西貢梨粗多糖的提取率為15.43%。本研究采用的超聲輔助提取法與傳統的熱水提取法相比，超聲提取法能有效地降低提取的最佳溫度，加快了粗多糖的提取效率，簡化粗多糖提取的步驟。在低溫條件下可以保證多糖結構的完整性，短時間低溫的提取可以減少更多能量的損耗，提高了多糖的提取效率。

通過對山西貢梨粗多糖的抗氧化活性試驗結果表明，山西貢梨粗多糖的提取物與抗壞血酸均能夠有效地清除DPPH·自由基和·OH自由基，山西貢梨粗多糖對DPPH·和·OH自由基均有較強的清除能力，在一定范圍內粗多糖濃度與兩種自由基的清除能力均呈線性相關。目前國內外有關山西貢梨粗多糖抗氧化活性的科學研究甚少，該數據可為山西貢梨精加工產品的研制提供一定的前期理論基礎，同時為進一步研究山西貢梨的營養成分保持提供前期數據基礎。