不同劑量10%水合氯醛在構建大鼠脊髓半切模型中的麻醉效果比較*

趙興昌 宋世強 唐毓金 劉 佳

1 右江民族醫學院，廣西百色市 533000； 2 邯鄲市中醫院； 3 右江民族醫學院附屬醫院

動物脊髓半切模型主要用于脊髓損傷后神經功能恢復的研究，將生物組織材料植入半切模型內[1]，觀察神經再生及動物活動情況。麻醉是構建脊髓半切模型成功的第一步，同時也是動物福利的要求。麻醉效果和安全性是保證實驗成功的重要步驟，如麻醉過淺、麻醉維持時間較短，則不能順利手術，同時也給動物造成痛苦；如麻醉過深、麻醉維持較長，則可能增加麻醉風險及死亡率，故選擇合適的麻醉藥物、藥物給藥途徑、藥物劑量非常重要。水合氯醛在構建脊髓半切模型實驗中應用較為廣泛，具有麻醉誘導快、麻醉維持時間和復蘇時間可通過劑量調節等優點[2]。但在查閱構建脊髓半切模型實驗的文獻中發現，在應用10%水合氯醛腹腔麻醉時劑量存在差異[3-5]，因此，比較不同劑量10%水合氯醛在構建大鼠脊髓半切模型時的麻醉效果，為科研人員動物實驗提供安全和有效的麻醉依據。

1 材料和方法

1.1 麻醉藥物及其配制 水合氯醛(成都市科隆化學品有限公司，批號：2018091101)，天平稱取10g水合氯醛加入到90ml滅菌0.9%氯化鈉溶液中，搖勻至完全溶解，配制成10%水合氯醛溶液，常溫保存備用。

1.2 實驗動物 8周齡SPF級SD大鼠，體重230～250g，均為雄性，共73只，由湖南長沙市天勤生物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(湘)2019-0014。飼養于右江民族醫學院動物實驗中心，室溫20～25℃，濕度50%～70%，飼料、水不受限制。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組:分組采用完全隨機化方法，將73只SD大鼠隨機分為三組，均使用10%水合氯醛溶液，3ml/kg組21只，3.5ml/kg組10只，4ml/kg組42只。

1.3.2 實驗操作步驟:(1)麻醉藥物腹腔注射。采用兩人操作法，一人抓取固定大鼠，保持頭低位，使內臟上移，以免注射藥物時注入臟器，另一人持1ml注射器自下腹中線旁以45°角刺入腹腔后，將腹壁挑起，回抽無血后緩慢注入藥物。放回鼠籠，記錄動物活動及麻醉效果各項指征，待大鼠完全麻醉后行脊髓半切模型手術操作。(2)構建脊髓半切模型(見圖1)。將大鼠取俯臥位固定于動物手術臺上，背部剃毛，碘伏消毒，鋪無菌單，觸摸肋骨為標志，以胸椎第10棘突為中心做一長約2cm正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，沿棘突正中切開筋膜和棘上韌帶，棘突兩側骨膜下鈍性剝離豎脊肌直到兩側關節突，顯露椎板，咬骨鉗咬除胸10棘突和椎板，暴露硬脊膜及脊髓。顯微鏡下以后正中靜脈為界線， 用眼科手術尖刀向右橫向切斷右半側脊髓，去除少許脊髓組織，將修復脊髓損傷生物材料支架植入，徹底止血后逐層縫合筋膜、皮下及皮膚。

圖1 構建脊髓半切模型

1.3.3 麻醉觀察指征：(1)麻醉誘導時間：指10%水合氯醛腹腔注射后至完全麻醉狀態的時間。完全麻醉狀態表現為大鼠呼吸規則、角膜反射消失、肌肉松弛、刺痛肢體無反應、夾尾反射消失等。(2)麻醉維持時間：指完全麻醉后持續的時間。至大鼠出現前肢微動、頭部活動即為進入麻醉復蘇期。(3)麻醉復蘇時間：指大鼠從出現肢體微動、刺痛肢體有反應、頭部活動到活動正常狀態所需要的時間。(4)麻醉時間：指10%水合氯醛腹腔注射時起至大鼠恢復到正常活動狀態所需要的時間。(5)構建脊髓半切模型時間：指大鼠完全麻醉后，從固定、剃毛、消毒、鋪單至手術完成時間。(6)麻醉死亡率：指各組麻醉后死亡例數占總體例數的百分率。

2 結果

2.1 麻醉誘導時間 3ml/kg組麻醉誘導時間(6.1±0.4)min；3.5ml/kg組麻醉誘導時間(4.4±0.2)min；4ml/kg組麻醉誘導時間(3.5±0.2)min。4ml/kg組起效時間最快，3ml/kg組起效時間最慢;且3ml/kg組與3.5ml/kg、4ml/kg兩組的麻醉誘導時間均存在明顯差異,具有統計學意義(P<0.001)；3.5ml/kg、4ml/kg兩組的麻醉誘導時間差異不顯著(P>0.05)，見圖2。

圖2 麻醉誘導時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg不同劑量三組,組間多重比較，**P<0.001

2.2 麻醉維持時間 3ml/kg組麻醉維持時間(72±4)min；3.5ml/kg組麻醉維持時間(103±3)min；4ml/kg組麻醉維持時間(109±7)min。3ml/kg組麻醉維持時間最短，4ml/kg組麻醉維持時間最長。3ml/kg與3.5ml/kg兩組存在明顯差異(P=0.001),且3ml/kg、3.5ml/kg兩組均與4ml/kg組存在明顯差異(P<0.001)，見圖3。

圖3 麻醉維持時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三種不同劑量組，組間多重比較，*P=0.001,**P<0.001

2.3 麻醉復蘇時間 3ml/kg組麻醉復蘇時間(102±4)min；3.5ml/kg組麻醉復蘇時間(144±4)min；4ml/kg組麻醉復蘇時間(132±4)min。3ml/kg組麻醉復蘇時間最短，3.5ml/kg組麻醉復蘇時間最長。三組間兩兩比較均數均存在明顯差異(P<0.001)，見圖4。

圖4 麻醉復蘇時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三種不同劑量組，組間多重比較，**P<0.001

2.4 麻醉時間 3ml/kg組麻醉時間(180±5)min；3.5ml/kg組麻醉時間(251±6)min；4ml/kg組麻醉時間(245±8)min。3ml/kg組麻醉時間最短，3.5ml/kg組麻醉時間最長。3.5ml/kg與4ml/kg兩組無明顯差異(P>0.05),而3ml/kg組與3.5ml/kg組、4ml/kg組均存在明顯差異，有統計學意義(P<0.001)，見圖5。

圖5 麻醉時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三種不同劑量組，組間多重比較，**P<0.001

2.5 構建脊髓半切模型時間 三組共73只大鼠構建脊髓半切模型方式、步驟相同，均在完全麻醉后，按固定、背部剃毛、術區消毒、鋪單、手術、包扎等步驟完成。造模時間平均用時(30±3)min，最長為38min，最短為26min。

2.6 麻醉死亡率 4ml/kg組42只大鼠中有2只麻醉死亡，死亡率為4.762%；3ml/kg組(21只)、3.5ml/kg組(10只)兩組均無死亡，死亡率均為0.000%；經χ2檢驗得出P=0.468 2,故三組死亡率差異不顯著，見圖6。

圖6 死亡率

3 討論

脊髓損傷是一種高致殘率、高致死率的疾病，損傷后軸突再生障礙造成功能恢復困難[6]。脊髓損傷可分為原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷指由外界暴力傷所致，而繼發性損傷為傷后發生的一系列自身過度反應激活的相對破壞過程，原發損傷后脊髓缺血缺氧，會使溶酶體內容物過度釋放以及鈣離子依賴的消化酶的激活，導致脊髓神經元細胞進一步壞死[7-8]。脊髓損傷區域挫傷、壓迫、出血甚至斷裂，在損傷較短時間甚至數小時內軸突發生變性、壞死[9-10]，造成脊髓結構及功能的損害，在受損脊髓的相應節段以下出現各種運動、感覺和括約肌功能障礙，肌張力異常及病理反射等的相應改變[11]，隨后脊髓水腫、缺血、炎癥因子的滲入、自噬啟動等均會造成微環境的改變使損傷區域進一步擴大，過程可能持續3周，隨著軸突的變性，病情進一步加重。在外力因素不能避免的情況下，目前重點集中在減輕繼發性損傷，縮短病程，減少損傷面積的進一步擴大，為軸突再生創造良好的微環境，促進軸突的生長或抑制膠質瘢痕的形成[12-13]。 內外性因素所致的脊髓損傷引起的神經元大量變性、壞死是脊髓損傷的重要病理機制[14]。

構建脊髓半切模型是研究生物組織材料修復神經損傷常用的一種方式，模型具有直觀、易重復等優點。構建模型需要良好的全身麻醉，使大鼠鎮靜、鎮痛、肌松。而水合氯醛能達到這種效果，被廣泛應用于動物實驗[15-17]。麻醉藥物的劑量要求適應手術的需要，劑量少、效果好、復蘇快為優選。現將實驗過程中應用10%水合氯醛不同劑量的麻醉效果總結如下：(1)三種不同劑量3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg均能滿足構建脊髓半切模型手術需要，能產生良好的麻醉效果。(2)麻醉誘導時間：3.5ml/kg、4ml/kg兩種劑量麻醉誘導差異不明顯(P>0.05)，而與3ml/kg組均存在明顯差異，劑量越大麻醉誘導時間越短，4ml/kg麻醉誘導時間最短。(3)麻醉維持時間：完全麻醉后維持時間對構建脊髓半切模型最為關鍵，是模型手術成功的前提。3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三組間差異顯著(P<0.05)，3ml/kg組麻醉維持時間最短，平均(72±4)min，但也能滿足構建模型所需時間[平均用時(30±3)min，最長為38min，最短為26min]；相比3.5ml/kg[(103±3)min]、4ml/kg[(109±7)min]，3ml/kg劑量最為合適。(4)麻醉復蘇時間：3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三組不同劑量間差異顯著，有統計學意義(P<0.001)。復蘇時間不隨劑量增大而延長，3ml/kg組復蘇時間最短(102±4min)，相比3.5ml/kg[(144±4)min]、4ml/kg[(132±4)min]，3ml/kg劑量最為合適。(5)麻醉時間：3.5ml/kg、4ml/kg兩組差異不明顯(P>0.05)，但均與3ml/kg劑量組存在顯著差異(P<0.001)。3ml/kg劑量麻醉時間最短[(180±5)min]，麻醉時間在滿足構建模型的前提下，時間越短越安全，相比3.5ml/kg[(251±6)min]、4ml/kg[(245±8)min]，3ml/kg劑量最為合適。(6)麻醉死亡率：除4ml/kg組死亡2例外(死亡率4.762%)，3ml/kg、3.5ml/kg均無死亡(死亡率0.000%)，3ml/kg、3.5ml/kg兩組優于4ml/kg組。

綜上所述，比較應用10%水合氯醛3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三組不同劑量麻醉時，應根據動物實驗所需時間而選擇，在滿足實驗的前提下，誘導快、維持時間短、復蘇快、麻醉時間短為首選，從而降低麻醉死亡率。3ml/kg劑量組誘導時間[(6.1±0.4)min]較3.5ml/kg組[(4.4±0.2)min]、4ml/kg組[(3.5±0.2)min]長約2min,對構建脊髓半切模型進程影響較小，但在麻醉維持、復蘇、麻醉時間、死亡率等方面均有優勢。因此，10%水合氯醛3ml/kg劑量腹腔注射麻醉效果在構建大鼠脊髓半切模型實驗中優于3.5ml/kg、4ml/kg兩種劑量。