miR-424靶向MEK1對白血病HL-60細胞系增殖、凋亡及阿霉素耐藥性的影響

戴進前，倪慶仁，張韻潔，任婧婧，李光，張曉波，宋艷萍西安市中心醫院西安市血液病研究所，陜西 西安 710003

白血病是人類造血干細胞發生惡性增殖的疾病，臨床上主要表現為髓細胞白血病、混合細胞白血病、淋巴細胞白血病等[1-2]。根據疾病發生緩急可分為以早幼粒細胞為主的急性白血病和以成熟細胞為主的慢性白血病，而急性髓系白血病是臨床上較為常見、死亡風險較高的一種血液系統惡性腫瘤[3]，給患者身體健康造成嚴重危害。目前，急性白血病主要通過化療和造血干細胞移植的方法進行治療，然而耐藥現象和移植后排斥反應嚴重影響治療療效[4]。選擇性免疫治療和各種分子靶向治療的發展逐漸成為白血病治療研究的新方向。微小RNA(miRNA)是一種短鏈非編碼RNA，在白血病中作為抑癌因子或癌基因發揮作用[5]。miR-424屬于miR-16家族成員，是一種抑癌基因，在多種腫瘤細胞和組織中低表達，與腫瘤細胞的增殖、凋亡和耐藥性有關，且在白血病患者治療反應中起重要作用[6-7]。有研究表明miR-424可促進單核細胞白血病細胞系分化為成熟單核細胞和巨噬細胞，調控白血病細胞生長，促進細胞成熟，可以作為治療白血病的潛在分子靶點[8]。本研究通過探索miR-424對白血病HL-60細胞增殖、凋亡及阿霉素(doxorubicin，ADM)耐藥性的影響，并探討其可能的作用機制，旨在為臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 正常人的外周血單核細胞PBMC(PCS-800-011)購自于美國ATCC細胞庫；人原髓細胞白血病細胞HL-60(貨號TCHu23)購自于中國科學院細胞庫。ADM(貨號T11090L)購自于美國TargetMol公司；qRT-PCR引物由上海吉瑪生物公司設計合成；反轉錄試劑盒(貨號K1622)、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試 劑盒(貨號11736059)購自于美國Thermo Fisher公司；Trizol(貨號T9424)購自于美國Sigma公司；熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號E2920)購自于美國Promega公司；熒光素酶報告載體由上漢恒生物公司提供；LipofectamineTM2000試劑盒(貨號11668027)購自于美國Invitrogen公司；兔抗人單克隆絲裂原活化蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1)抗體(貨號ab32091)、兔抗人多克隆Ki67抗體(貨號ab15580)、兔抗人多克隆Bcl-2抗體、兔抗人多克隆Bax抗體(貨號ab32503)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(貨號：ab205718)均購自于英國Abcam公司。CCK8細胞增殖試劑盒(貨號C0037)、Annex V-FITC凋亡試劑盒(貨號C1062)、RIPA裂解液(貨號P0013)、BCA蛋白檢測試劑盒(貨號P0012)購自于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器 酶標儀(型號SpectraMax iD3)購自于美國Molecular Devices公司；流式細胞儀(型號BD FACSCantoⅡ)購自于美國Becton-Dickinson公司，電泳儀(型號1658001)購自于美國Bio-Rad公司，CO2培養箱(型號CB53)購自于德國Binder公司，實時熒光定量PCR儀(型號ABI 7500)購自于美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 正常人的外周血單核細胞PBMC、白血病細胞HL-60分別以RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)置于37℃、5%的CO2培養箱中培養，2 d換液一次，0.25%的胰蛋白酶消化離心傳代培養，取對數生長期細胞用于以下實驗。

1.3.2 轉染及分組 收集1.3.1中細胞PBMC、HL-60以密度為4×105個/孔、每孔2 mL接種于6孔板中，置于培養箱中培養，待細胞融合至70%時，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，將miR-424 NC、miR-424 mimic分別轉染至HL-60細胞中，每組8個復孔，將細胞HL-30分為NC組、miR-424 mimic組，分別以僅添加新鮮培養液的HL-60細胞和PBMC細胞作為空白對照組和正常對照組。

1.3.3 qRT-PCR檢測白血病HL-60細胞中miR-424、MEK1 mRNA相對表達水平 轉染48 h后，收集1.3.2中PBMC及各組HL-60細胞，用Trizol法提取總RNA，根據引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物(序列如表1所示)，按照反轉錄試劑盒對RNA合成cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配20μL反應體系并進行擴增。反應條件為：95℃預變性15 min，95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個循環，以U6、GAPDH為對照，采用2-△△Ct法分析miR-424和MEK1 mRNA相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 CCK8檢測白血病HL-60細胞增殖 收集1.3.2中各組HL-60細胞，并以密度2×104/孔每孔200μL，鋪于96孔板，分別在轉染24 h、48 h、72 h后加入CCK8試劑，按照CCK8試劑盒說明書進行操作，檢測450 nm波長下各孔細胞吸光度值(OD)值，統計數據分析各組細胞的增殖情況。細胞相對增殖率=(轉染組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.5 流式細胞術檢測白血病HL-60細胞凋亡 收集1.3.2中各組HL-60細胞，按照Annex V-FITC凋亡試劑盒方法在流式細胞儀上檢測每組細胞的凋亡率。

1.3.6 CCK8檢測HL-60細胞對ADM的敏感性 收集1.3.2中各組細胞，每組分別加入含終濃度為0、0.08μmol/L、0.16μmol/L、0.64μmol/L ADM的培養基，繼續培養48 h后按照CCK8試劑盒說明書檢測各組細胞各孔細胞OD值，計算分析各組半數抑制濃度(IC50)。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測白血病HL-60細胞與MEK1的靶向關系 分別構建含有野生型MEK1的野生型和突變型3'-UTR序列的熒光素酶報告基因質粒(MEK1-Wt和MEK1-Mut)。收集白血病HL-60細胞，調整細胞密度為2×105/孔，接種于24孔板中，miR-424 mimic或NC分別與MEK1-Wt質粒和MEK1-Mut質粒共同轉染至白血病HL-60細胞，每組8個復孔，繼續培養48 h。按照熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明對熒光素酶活性測定。

1.3.8 Western blot檢測白血病HL-60細胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表達 收集1.3.2中各組HL-60細胞，PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液在冰水浴中處理，提取蛋白，BCA法測定各組蛋白的濃度，按照4∶1在蛋白中加5×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備10%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據蛋白Marker切膠，轉膜，對抗體MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax均按照1∶500的比例稀釋后4℃孵育過夜，放搖床1.5 h，TBST清洗，加入HRP標記的二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗后，參考ECL發光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。Image J軟件對條帶灰度值進行分析。

1.4 統計學方法 應用SPSS23.0軟件對數據進行統計分析，計量數據以均數±標準差(x-±s)表示，多組計量數據比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中miR-424、MEK1 mRNA相對表達水平比較 與正常對照組相比，空白對照組、NC組HL-60細胞中miR-424相對表達水平顯著降低，MEK1 mRNA相對表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與空白對照組、NC組相比，miR-424 mimic組HL-60細胞中miR-424相對表達水平顯著升高，MEK1 mRNA相對表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組細胞中miR-424、MEK1 mRNA相對表達水平(±s，n=8)

表2 各組細胞中miR-424、MEK1 mRNA相對表達水平(±s，n=8)

注：與正常對照組比，a P＜0.05；與空白對照組比，b P＜0.05；與NC組相比，c P＜0.05。

組別正常對照組空白對照組NC組miR-424 mimic組F值P值miR-424/U6 1.01±0.15 0.46±0.13a 0.45±0.14a 1.09±0.16bc 45.046＜0.05 MEK1/GAPDH 1.03±0.23 1.72±0.32a 1.70±0.28a 1.25±0.25bc 12.579＜0.05

2.2 過表達miR-424對白血病HL-60細胞增殖能力影響 與空白對照組、NC組相比，同一時間miR-424 mimic組白血病HL-60細胞相對增殖率顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 miR-424過表達對白血病HL-60細胞相對增殖率的影響(±s，n=8)

表3 miR-424過表達對白血病HL-60細胞相對增殖率的影響(±s，n=8)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05；與NC組相比較，b P＜0.05。

組別空白對照組NC組miR-424 mimic組F值P值24 h 99.98±13.31 98.32±12.85 55.18±12.01ab 31.825＜0.05 72 h 101.64±14.86 99.78±13.05 50.24±12.03ab 38.068＜0.05 48 h 100.12±13.01 98.99±12.78 52.19±11.01ab 39.566＜0.05相對增殖率(%)

2.3 過表達miR-424對白血病HL-60細胞凋亡能力影響 與空白對照組、NC組相比，轉染48 h后miR-424 mimic組白血病HL-60細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 miR-424過表達對白血病HL-60細胞凋亡的影響(±s，n=8)

表4 miR-424過表達對白血病HL-60細胞凋亡的影響(±s，n=8)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05；與NC組相比較，b P＜0.05。

組別空白對照組NC組miR-424 mimic組F值P值凋亡率(%)12.21±3.26 13.76±4.29 51.10±5.56ab 194.118＜0.05

2.4 過表達miR-424對白血病HL-60對ADM的敏感性 用藥48 h后，在相同藥物濃度下，與空白對照組組、NC組相比，miR-424 mimic組HL-60細胞IC50值顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表5。

2.5 miR-424對白血病HL-60細胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與空白對照組、NC組相比，miR-424 mimic組HL-60細胞MEK1、Ki67、Bcl-2蛋白相對表達水平均顯著降低，Bax蛋白相對表達水平均顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1、表6。

表5 miR-424過表達對白血病HL-60細胞對ADM敏感性比較(±s，n=8)

表5 miR-424過表達對白血病HL-60細胞對ADM敏感性比較(±s，n=8)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05；與NC組相比較，b P＜0.05。

組別空白對照組NC組miR-424 mimic組F值P值IC50(μmol/L)0.46±0.05 0.44±0.06 0.20±0.05ab 58.419＜0.05

圖1 各組HL-60細胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡圖

表6 各組HL-60細胞中MEK1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表達比較(±s，n=8)

表6 各組HL-60細胞中MEK1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表達比較(±s，n=8)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05；與NC組比較，b P＜0.05。

組別空白對照組NC組miR-424 mimic組F值P值MEK1 0.88±0.11 0.89±0.13 0.30±0.10ab 70.215＜0.05 Ki67 0.77±0.08 0.80±0.09 0.29±0.07ab 101.320＜0.05 Bcl-2 0.73±0.06 0.76±0.07 0.35±0.06ab 103.603＜0.05 Bax 0.21±0.06 0.19±0.05 0.72±0.08ab 173.248＜0.05

2.6 miR-424與MEK1的靶標關系 如圖2所示，microrna.org數據庫預測MEK13'-UTR與miR-424存在結合位點。與miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR組比較，miR-424 mimic+WT-MEK1 3'-UTR組熒光素酶相對活性顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；miR-424 NC+MUT-MEK13'-UTR組、miR-424 mimic+MUT-MEK1 3'-UTR組熒光素酶相對活性差異無統計學意義(P＞0.05)，見表7。

圖2 microrna.org數據庫預測MEK1基因靶向圖

表7 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-424與MEK1靶向關系(±s，n=8)

表7 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-424與MEK1靶向關系(±s，n=8)

注：與miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR組比較，a P＜0.05。

組別miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR組miR-424 mimic+WT-MEK1 3'-UTR組miR-424 NC+MUT-MEK1 3'-UTR組miR-424 mimic+MUT-MEK1 3'-UTR組F值P值熒光素酶的相對活性2.47±0.22 1.69±0.13a 2.44±0.33 2.40±0.29 15.792＜0.05

3 討論

白血病是由造血干細胞惡性克隆而引發的一種疾病，具有無限增殖、凋亡受阻、分化障礙等特點，造血干細胞在骨髓或其他造血組織中大量堆積，可以抑制造血功能，急性髓系白血病是臨床多發性白血病，約占成人白血病的70%[9]，目前，通過手術和傳統的化療藥(如ADM)在白血病中的治療已難以達到預期的效果，隨著生物分子學的發展，miRNA在白血病中的作用已成為近年來研究熱點。

miR-424是一種抑癌基因，對細胞周期和凋亡具有調控作用，與血液惡性腫瘤發生發展有關。如KHARE等[10]研究發現彌漫性大B細胞淋巴瘤患者血漿中miR-424的表達顯著低于健康對照組。HERSHKOVITZ-ROKAH等[11]研究發現miR-424在慢性髓系白血病患者細胞系和血液中的表達均顯著低于正常人，且miR-424過表達能夠抑制人類髓系白血病細胞K562的增殖，誘導細胞的凋亡和對藥物敏感。本研究發現，白血病細胞HL-60中miR-424表達顯著低于PBMC細胞，提示miR-424可能與白血病發生有關。因此本研究通過體外培養白血病HL-60細胞系，探討過表達miR-424對HL-60增殖、凋亡及耐藥性的影響。

細胞增殖是細胞生命活動的基礎，而腫瘤細胞是一種細胞周期失控、可無限增殖的細胞[12]。已有研究表明，Ki67在細胞間期和有絲分裂期都有重要作用，在無限增殖的細胞中高度表達，Ki67作為細胞的增殖標志物已經被廣泛應用[13]。細胞凋亡和增殖處于動態平衡，抗凋亡基因Bcl-2過表達可使細胞凋亡過程受阻，而促凋亡基因Bax則可拮抗Bcl-2的生物學過程從而誘導細胞凋亡[14]。本研究發現，miR-424 mimic組HL-60細胞增殖率、Ki67蛋白相對表達水平顯著低于空白對照組，提示miR-424過表達可抑制HL-60細胞增殖。本研究發現，miR-424 mimic組HL-60細胞增殖率、蛋白KI67、Bcl-2表達顯著低于空白對照組，細胞凋亡率、Bax蛋白相對表達水平顯著高于空白對照組，提示miR-424過表達可抑制細胞HL-60的增殖，促進細胞凋亡。機體的耐藥性與細胞對藥物的敏感性有關，阿霉素是臨床治療白血病的一線藥物，而白血病細胞對該藥物產生耐藥性成為影響白血病化療失敗的重要因素[15]。研究發現，miRNA不僅參與癌癥細胞增殖、分化、凋亡等生理過程，而且miRNA失調還影響癌細胞的耐藥性[16]。本研究發現，miR-424 mimic組白血病HL-60細胞IC50值顯著低于空白對照組，提示miR-424過表達促使HL-60細胞對ADM的敏感性增加，耐藥性降低。

MEK1是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員，又稱MAP2K1，在細胞增殖和凋亡中發揮作用[17]。有研究發現miR-16通過靶向抑制MEK1激酶1(MEK1)調節ERK/MEK1信號途徑抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[18]。此外，WANG等[19]研究發現miR-181a可靶向MAP2K1調節ERK/MAPK信號途徑抑制白血病細胞增殖，誘導細胞凋亡，降低白血病細胞對ADM的耐藥性。本研究發現，與PBMC細胞相比，白血病HL-60細胞中MEK1的相對表達水平顯著升高，提示MEK1可能與白血病的發生有關。本研究還發現過表達miR-424能夠抑制HL-60細胞中MEK1的表達。miRNA通過與其下游靶基因3'-UTR區結合調節基因的表達。進一步采用TargetScan、microRNA.org、miRGene數據庫預測miR-424靶基因，發現miR-424與MEK1存在結合位點，進一步采用雙熒光素酶報告實驗驗證發現，WT-miR-424 mimic+MEK1 3'-UTR組的熒光素酶相對活性低于WT-miR-424 NC+MEK1 3'-UTR組，提示miR-424能夠靶向MEK1，調控其表達，兩者可能共同影響HL-60的發生及耐藥性，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，上調miR-424可能通過靶向抑制MEK1表達，抑制白血病細胞HL-60的增殖，促進細胞凋亡，逆轉細胞對阿霉素的耐藥性，為白血病的靶向治療提供新思路。本研究的不足之處在于沒有用敲除或低表達miR-424的方法以驗證沉默miR-424對HL-60細胞生物學活性及耐藥性的調節是否能發生逆轉，從而進一步確認miR-424調節白血病發生發展的作用。