系統性硬化癥并間質性肺疾病與外周血T細胞亞群的相關性研究

李國銓，郭峰，王敏，葉鳳，鄭顏萍

海南醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，海南 海口 570100

系統性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種異質性自身免疫疾病，其主要特征包括皮膚及內臟纖維化、免疫異常、閉塞性微血管損傷等，隨著疾病的進展，可導致機體多器官纖維化，危及患者生命安全[1]。間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是SSc患者常見的并發癥之一，也是最為嚴重的繼發病癥。有資料顯示[2]，系統性硬化癥并間質性肺疾病(systemic sclerosis associated interstitial lung disease，SSc-ILD)患者發病后的10年內致死率高達40%。目前，關于SSc-ILD的具體發病機制尚無報道明確闡述，但國內外諸多相關研究推動了SSc-ILD的發展，也增加了醫學領域對該病癥的認知。2016年雷玲等[3]報道指出SSc患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞比例增加，不同表型CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CD127-細胞比例與肺纖維化病變呈正相關性。VOLKMANN等[4]也指出SSc患者T淋巴細胞免疫功能紊亂、持續炎癥反應等是導致SSc-ILD發病的重要因素。基于此，本研究分析了SSc-ILD與外周血T細胞亞群的相關性，以期為SSc-ILD的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年12月期間海南醫學院第一附屬醫院風濕免疫科收治的40例SSc患者為研究對象，其中男性8例，女性32例；年齡24～78歲，平均(47.38±9.75)歲；病程6個月～19年，平均(3.12±0.92)年；臨床癥狀表現：指端潰瘍8例，雷諾現象27例，關節腫脹11例。入組標準：①均符合美國風濕協會SSc的分類標準[5]；②近半年內未使用過免疫抑制劑的已確診患者或新發SSc患者；③患者及家屬對檢測內容、注意事項知情，且簽署自愿參與書；④臨床資料齊全；⑤依從性高。排除標準：①合并惡性腫瘤者；②存在急性感染者；③合并其他結締組織病者；④因其他原因導致的藥物性或特發性間質性肺病；⑤肝臟、心臟、腦、血液等重要臟器或系統患有嚴重疾病者。本研究已獲得本院倫理委員會的審核批準。

1.2 方法

1.2.1 外周血T細胞亞群水平檢測 采用EDTA-K2抗凝真空采血管抽取患者清晨空腹狀態下靜脈血2 mL。取一支流式專用管，加入20μL的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC/CD45-PC7四色試劑和100μL全血，充分混勻，在溫室下避光孵育15 min。隨后加入2 mL的FACELysing溶血液，避光孵育10 min，在1 500 r/min條件下離心處理5 min，棄上清液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，再離心處理5 min，棄上清液。最后加入PBS緩沖液重懸，以流式細胞儀測定各細胞比例，包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值。

1.2.2 高分辨率CT(HRCT)檢查 采用西門子公司的64排螺旋CT掃描儀對所有入組患者進行HRCT檢查。患者取仰臥位，雙手抱頭，在靜息狀態下深吸氣后屏氣，從胸廓入口至肺底進行掃描。參數設置：管電壓120 kV，管電流200 mAs，掃描層厚5 mm，層距5 mm。檢查完成后將獲得的影像信息傳輸至后臺工作站以iDose4迭代算法、Y-Detail方式、Standard(B)方式進行圖像重建，觀察肺部、縱隔及雙肺門表現。根據HRCT征象可將ILD分為0級、1級、2級、3級。具體評價方式為：0級表示未合并ILD，檢查結果無明顯異常；1級表示疑似合并ILD，出現局部或單側的磨玻璃、網狀或斑片狀陰影，累及區域＜5%；2級表示合并輕度ILD，出現非依賴性磨玻璃或網狀陰影、彌漫性小葉中心結節、非肺氣腫性囊腫、支氣管擴張等改變，且這些改變可分布于任何肺葉區域，累及范圍≥5%；3級表示合并重度ILD，胸膜下多葉纖維化，伴有蜂窩狀和牽引性支氣管擴張。為確保檢查結果的客觀性，所有患者HRCT評分均由2名經驗豐富的影像學醫師單獨進行，若兩者評分結果一致則納入數據庫，若兩者意見相左，則加入第3名影像學醫師進行討論確定結果。

1.3 觀察指標 (1)基本臨床特征：根據SSc患者是否合并ILD分為SSc-ILD組和SSc-Non-ILD組，比較兩組基本臨床特征，包括性別、年齡、病程、吸煙史、臨床表現等；(2)外周血T細胞亞群水平：比較SSc-ILD組和SSc-Non-ILD組患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值；(3)ILD分級與外周血T細胞亞群水平的相關性：分析HRCT征象下ILD分級與外周血T細胞亞群水平的相關性，評價SSc-ILD與外周血T細胞亞群的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0統計學軟件進行數據處理，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Pearson檢驗分析SSc患者ILD分級與外周血T細胞亞群的相關性；繪制受試者工作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計算外周血T細胞亞群的曲線下面積(areas under curve，AUC)，并分析其對SSc-ILD的敏感性和特異性；均以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的基本臨床特征比較 根據HRCT檢查結果，40例SSc患者中合并ILD者16例，未合并ILD者24例，SSc-ILD的發病率為40.0%(16/40)。兩組患者的年齡、性別、臨床表現等基本特征比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，但SSc-ILD組患者病程長于SSc-Non-ILD組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組患者的基本臨床特征比較

2.2 兩組患者外周血T細胞亞群水平比較 兩組患者的CD4+水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)；SSc-ILD組患者的CD8+水平明顯高于SSc-Non-ILD組，CD3+、CD4+/CD8+水平明顯低于SSc-Non-ILD組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。+

表2 兩組患者的外周血T細胞亞群水平比較(±s)

表2 兩組患者的外周血T細胞亞群水平比較(±s)

組別SSc-ILD組SSc-Non-ILD組t/χ2值P值例數16 24 CD3+(%)66.73±11.32 70.51±10.84 4.013 0.001 CD4+(%)36.61±8.74 37.24±7.95 0.428 0.556 CD8+(%)33.64±7.28 29.56±6.52 4.957 0.001 CD4+/CD8 1.13±0.25 1.58±0.35 4.435 0.001

2.3 SSc患者HRCT下ILD分級與外周血T細胞亞群的相關性 Pearson相關性檢查結果顯示，SSc患者ILD分級與CD3+呈負相關性(r=-0.755，P=0.000)，與CD4+無明顯相關性(r=-0.020，P=0.351)，與CD8+呈正相關性(r=0.845，P=0.000)，與CD4+/CD8+呈負相關性(r=-0.659，P=0.000)，見圖1～圖4。

圖1 SSc患者ILD分級與外周血CD3+水平分布散點圖

圖2 SSc患者ILD分級與外周血CD4+水平分布散點圖

圖3 SSc患者ILD分級與外周血CD8+水平分布散點圖

圖4 SSc患者ILD分級與外周血CD4+/CD8+水平分布散點圖

2.4 外周血T細胞亞群對SSc-ILD診斷的敏感度和特異度 經ROC曲線分析結果顯示，CD3+、CD8+、CD4+/CD8的AUC分別為0.745、0.797、0.667，具有良好的陽性參考價值。CD3+最佳截斷值為67.65，敏感度為79.2%，特異度為68.4%；CD8+最佳截斷值為32.70，敏感度為83.8%，特異度為71.1%；CD4+/CD8+最佳截斷值為1.29，敏感度為75.0%，特異度為73.7%，見表3、圖5。

圖5 SSc-ILD中外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的ROC曲線圖

表3 SSc-ILD中外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的ROC曲線分析結果

3 討論

作為一種彌漫性結締組織病，SSc常累及肺部、消化道等重要臟器，其中合并ILD的發生率高達25%～90%，嚴重影響患者預后[6]。受限于SSc-ILD發病機制仍不明確，臨床在治療SSc-ILD時往往沒有準確的目標，不但增加醫療支出，并且可能出現各種藥物相關的不良反應。目前，SSc-ILD的治療方案主要包括免疫抑制劑、抗纖維化藥物等，實際治療效果和用藥安全性欠佳[7]。因此，有學者提出，了解SSc-ILD患者機體各細胞因子、信號通路、免疫系統之間的相互聯系，提高SSc-ILD的認知和理解，對尋求新的治療靶點、治療方向至關重要[8]。

本研究主要探討了SSc-ILD與外周血T細胞亞群之間的關系，分析T淋巴細胞免疫應答對SSc-ILD發病的影響，并評估其機體免疫狀態，以期為SSc-ILD患者制定科學、合理的治療方案。通常而言，人體正常情況下的T淋巴細胞亞群水平維持在一個平衡狀態，發揮著正常的免疫功能，當機體發生病變時，可能導致T淋巴細胞亞群發生不同程度的改變，客觀地反映出機體免疫狀況。AYANO等[9]學者指出，ILD發生與自身免疫損傷有關，在彌漫性肺疾病時，CD8+被認為可依據抗原刺激發揮細胞毒性或抑制作用。另外，在國內的一項研究中，張亮等[10]學者分析了結締組織病并間質性肺病變(CTD-ILD)患者外周血T細胞亞群，指出CTD-ILD患者的CD8+水平明顯升高，認為體內發生免疫功能的紊亂是導致CTD-ILD發生的重要危險因素，這與本研究結果相似。在免疫學上，CD3表示總T細胞水平，CD4+/CD8+則是機體免疫調節的核心環節，一旦失衡說明機體細胞免疫功能發生異常改變[11]。但是，在國內外相關報道中，關于外周血T淋巴細胞亞群水平與SSc-ILD的相關性尚無系統性研究，這也是本研究的主要目的之一。通過對確診SSc患者進行胸部薄層CT及外周血T細胞亞群檢測，評價T細胞研究在SSc-ILD發病中的作用。

本研究中，SSc-ILD組患者的CD8+水平明顯高于SSc-Non-ILD組，CD3+、CD4+/CD8+水平低于SSc-Non-ILD組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，說明SSc-ILD患者免疫細胞分布異常，T細胞亞群失衡，導致體內發生明顯的免疫功能紊亂。此外，國內諸多學者研究了淋巴細胞免疫分型與間質性肺疾病的關系[12-13]，指出SSc-ILD、單純SSc以及健康對照組之間的CD3+、CD4+/CD8+均存在顯著性差異，說明T細胞亞群失衡可能參與了該疾病的進展。但上述研究并沒有對SSc-ILD疾病分級與T細胞亞群的關系進行探究，也缺少這類指標對SSc-ILD臨床診療的價值評估。為了進一步探討外周血T細胞亞群水平與SSc-ILD的關系，本研究基于HRCT對SSc患者進行ILD分級，并分析了其與外周血T細胞亞群的相關性。結果顯示，SSc患者ILD分級與CD3+、CD4+/CD8+呈負相關性(r=-0.755、-0.659，P＜0.05)，與CD8+呈正相關性(r=0.845，P=0.000)，由此可見機體免疫功能狀況與SSc-ILD的發生、進展密切相關，這在王妞[14]的研究中也得以體現。該結果無疑為臨床治療SSc-ILD提供了有建設性的參考依據：SSc合并ILD時，機體外周血T細胞亞群數量或功能發生改變，若在該階段進行針對性的免疫學異常干預，可能有利于提高系統性硬化病和肺部病變的治療效果，進而改善患者預后。

SSc-ILD起病隱匿，患者在發病初期缺乏特異性臨床表現，容易出現誤診、漏診，部分患者在確診時已發展為不可逆的肺纖維化，造成嚴重的肺功能損傷。因此，早期給予有效的臨床診斷具有重要的意義。HRCT是診斷SSc-ILD的有效手段，可取得與ILD病理學檢查一致的結果。也有學者證實了血清趨化因子-4[15]、中性粒細胞-淋巴細胞比率[16]在SSc-ILD中的診斷價值。本研究通過繪制ROC曲線分析顯示，CD3+、CD8+、CD4+/CD8+水平的對SSc-ILD的AUC分別為0.745、0.797、0.667，具有良好的陽性參考價值(AUC均＞0.5)，且敏感度、特異度良好，提示外周血T細胞亞群水平檢測可作為臨床診斷SSc-ILD的有效指標，對早期篩查SSc-ILD可能具有輔助性作用。劉培培等[17]研究了淋巴細胞免疫分型對ILD的臨床價值，指出外周血T淋巴細胞亞群改變有助于臨床識別免疫性損傷引發的結締組織病相關間質性肺病變，與本研究結論相符。

綜上所述，SSc患者免疫功能紊亂與其并發ILD密切相關，外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+水平改變不僅對SSc-ILD病情評估和臨床診斷具有重要的價值，同時對該疾病的治療和預后有一定的指導性意義。但本研究存在一定的不足之處，如病例納入數較少，且為單中心研究，病例均來自海南省，可能存在統計學誤差及地域性差異；此外，未深入探究外周血T細胞亞群與SSc-ILD患者臟器受累、療效檢測及預后之間的關系，需要后續繼續深入研究。