綠豆Dof家族基因的生物信息學分析及鹽脅迫下的表達分析

張文慧，杜吉到，賀登美，谷心茹，黃 勇，國鳳雙

(黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163319)

【研究意義】綠豆(Vignaradiate)，豆科作物，在我國有兩千多年的栽培歷史。由于綠豆具有藥用、保健、營養等價值，近年來人們對綠豆的需求呈上升的態勢，但在我國北方一些綠豆主產區受土壤鹽漬化、干旱等環境條件限制，綠豆產量維持在較低水平。因此，對綠豆的轉錄因子基因家族基因進行分析，明確基因家族的結構特點、探究其在綠豆生長發育及抗逆方面的功能非常必要。植物在生長發育過程中能夠感受鹽堿、低溫、干旱等外界環境以及體內細胞發育的信號，通過一系列的信號傳遞啟動下游相關功能基因的轉錄表達，最后通過基因產物對各種信號在生理生化等方面做出適當的調節反應，因此，轉錄因子激活或抑制下游相關基因的表達是植物脅迫應答反應及調節自身生長發育的重要過程。Dof(DNA binding with one finger)家族是一個具有典型鋅指結構域的轉錄因子家族，是植物中特有的一類轉錄因子[1-3]。它的DNA結合域是由52個氨基酸組成的C2-C2型鋅指結構，可以特異性的識別并結合下游基因啟動子中核心序列為“T/AAAAG”的元件，激活或抑制下游基因的表達[4-5]。Dof蛋白的羧基端序列保守程度很低，不同成員之間差異很大，可以不同的方式調控蛋白互作，增加了Dof蛋白功能的多樣性[6-7]。【前人研究進展】目前，Dof家族基因已經在擬南芥、水稻、大豆、玉米、甜瓜、番茄等多種植物中被分離鑒定出來[8-12]。Dof基因對植物的生長發育、碳水化合物的代謝、細胞的防御反應、激素信號轉導、種子萌發等方面都具有調控作用[13]。研究表明，甜瓜CmDof6、CmDof10和CmDof17基因可以被 PEG 脅迫顯著誘導[11]；轉番茄基因SlCDF1和SlCDF3的擬南芥植株提高了對鹽和干旱脅迫的抗性[14]；過表達OsDof12基因的水稻株系在長日照條件下會導致花期提前[15]；玉米Dof家族基因參與玉米的生理發育過程，并且對氮代謝調控起著重要作用[10]。【本研究切入點】目前，對Dof家族進行了研究的作物主要包括水稻、玉米、大豆、高粱等，對綠豆Dof基因的研究則未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究在綠豆轉錄組數據的基礎上，對綠豆Dof家族基因進行鑒定，通過生物信息學的方法對Dof基因的染色體定位、基因結構、系統進化、鹽脅迫下的表達模式等進行分析。此研究為進一步探究Dof基因在綠豆生長發育及抗逆方面的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 綠豆Dof家族基因的鑒定和生物信息學分析

本實驗是在對吉綠10號進行轉錄組測序的基礎上進行的。在轉錄組數據中搜索Dof基因，獲得Dof基因的Gene ID，利用Gene ID在NCBI的綠豆基因組數據庫中搜索獲得Dof基因序列。利用NCBI的保守結構域查找軟件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi確定Dof蛋白的保守結構域，使用Bioedit軟件進行多序列比對。通過網站http://web.expasy.org/protparam/分析Dof蛋白的理化性質；通過網站https://www.genscript.com/wolf-psort.html和http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/分別預測ERF蛋白的亞細胞定位和磷酸化位點數目及種類；通過網站http://meme-suite.org/tools/meme 對Dof蛋白motif進行預測；利用TBtools軟件構建綠豆Dof家族蛋白的系統進化樹、分析Dof基因結構，并將系統進化、基因結構、蛋白基序分析結果可視化作圖。

1.2 綠豆和擬南芥Dof蛋白的系統進化及鹽脅迫下的表達分析

從 TAIR數據庫(https：//www.arabidopsis.org/)獲得擬南芥Dof蛋白序列，用MEGA7.0軟件的鄰接法對綠豆和擬南芥Dof蛋白進行系統進化分析，Bootstrap 值設置為 1000，其他參數均為默認值。根據本實驗室的轉錄組測序結果中Dof家族基因的FPKM值分析Dof家族基因在鹽脅迫下6、12和24 h的表達模式，并用R語言繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 綠豆Dof家族基因的鑒定及理化性質分析

圖1顯示，根據轉錄組數據中Dof家族基因的Gene ID在NCBI綠豆基因組數據庫中獲得41個綠豆Dof基因序列，用BioEdit軟件對Dof蛋白的結構域進行分析，發現41個綠豆Dof的結構域高度保守，且均含有1個CX2CX21CX2C基序，可進一步形成C2-C2單鋅指結構。因此，可以確定搜索到的41條基因均為綠豆Dof家族基因。按照這些基因在染色體上的位置，依次命名為VrDof1～VrDof41。

圖1 綠豆Dof基因保守結構域多序列比對

由表1顯示，對41條綠豆Dof家族基因在染色體上的位置及理化性質等進行分析，Dof基因不均勻的分布在除6號染色體外的1～11號染色體上，1號染色體只有1條Dof基因、2號染色體包含3條、3號染色體2條、4號染色體5條、5號染色體2條、7號染色體10條、8號染色體2條、9號染色體2條、10號染色體5條，11號染色體3條，還有6條Dof基因沒有被定位在染色體上；Dof基因的CDS分布范圍為498～1506 bp，編碼的氨基酸數目在165～501之間，包含氨基酸殘基數目最少的為VrDof29(165個)，最多的是VrDof10(501個)；分子量大小在19.23～54.60 Kd；等電點在5.44～9.99。

表1 綠豆Dof家族基因的基本信息

2.2 綠豆Dof蛋白的亞細胞定位和磷酸化位點預測

由表2顯示，41個綠豆Dof蛋白的磷酸化位點數目分布在5～28之間，不同蛋白磷酸化位點數目差異很大，從3種磷酸化位點的數目上看，絲氨酸磷酸化位點數目最多，蘇氨酸磷酸化位點次之，酪氨酸最少。亞細胞定位方面，所有41個Dof蛋白都定位在細胞核里。

表2 綠豆Dof蛋白的亞細胞定位和磷酸化位點分析

2.3 綠豆Dof家族蛋白的系統進化分析

參考Lijavetzky等(2003)對擬南芥和水稻Dof家族基因的分類方法[8]，用MEGA7.0軟件對鑒定出的41條綠豆Dof蛋白序列和分布在Dof各組的25條擬南芥蛋白序列進行多序列比對及系統進化分析(圖2)。與擬南芥的分類結果略有不同，綠豆Dof家族蛋白可以被分為A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、D1和D2共8個組，沒有Dof成員和擬南芥的C3組蛋白聚集在一起(圖1)。不同組間成員分布不均，聚集到D1組的成員數目最多，共有11個綠豆Dof蛋白，其次是B2 組，包含8個綠豆Dof蛋白，最少的是D2組，只包含1個綠豆Dof蛋白。另外，A組包含4個綠豆Dof蛋白、B1組包含5個、C1組5個、C2.1組4個、C2.2組3個。擬南芥共有36個Dof蛋白，分布在D1組的成員最多，其次是B1組，分別為7個和5個，在整個擬南芥Dof家族中占比為19.4%和13.9%，與綠豆相似，綠豆成員最多的也是D1組，占比為26.8%，高于擬南芥的比例，其次是 B2組，占比為19.5%。

圖2 綠豆和擬南芥Dof家族蛋白的系統進化樹

2.4 綠豆Dof家族蛋白的系統進化和保守基序分析

通過TBtools軟件對綠豆Dof家族蛋白進行系統進化分析(圖3-A)與圖結果一致，將綠豆Dof基因分為8個組。通過MEME對綠豆Dof家族蛋白的保守基序進行分析(圖3-B)，結果鑒定出15個保守基序。其中，Motif1是Dof家族蛋白的結構域，為綠豆Dof家族成員共有，可形成C2-C2單鋅指結構。A組成員包含Motif1、9、11和12；B1組包含Motif1、6、10、14、15，其中Motif6不存在于其它組，為B1組特有；B2組成員主要含有Motif1和Motif11；C1組成員含有Motif1、10、13、14、15，其中13為C1組特有；C2.1組成員含有Motif1、10、12；C2.2組成員含有Motif1、12；14；D1組成員含有Motif1、2、3、4、5、7、8、9、12，除了Motif1和Motif12外，其余的7種Motif均為D1組特有；D2組只有1個成員，與B2組類似，只含有Motif1。結合系統進化分類來看，同一組別內的成員含有的保守基序種類、數目和排列順序相似，不同組別之間包含的基序不同，大多數組別都有區別于其它組別的基序。

圖3 綠豆Dof家族蛋白的系統進化(A)、基因結構(B)及保守基序(C)分析

2.5 綠豆Dof家族基因的結構分析

利用TBtools軟件對綠豆Dof家族基因的結構進行分析(圖3-C)，聚類在同一組中的Dof基因具有相似的基因結構。綠豆Dof家族基因的外顯子在1～3個之間，除VrDof1和VrDof15外顯子數目為3個外，其余基因的外顯子都為1～2個。綠豆Dof家族基因的內含子在0～2個之間，VrDof1和VrDof15含有2個內含子，19個Dof基因含有1個內含子，其余20個基因不含有內含子。

2.6 綠豆Dof家族基因在鹽脅迫下的表達模式分析

在本實驗室測得的綠豆在鹽脅迫下的轉錄組數據中查找Dof家族基因表達的FPKM值，利用R軟件的pheatmap軟件包繪制基因表達熱圖(圖4)。由于VrDof20在正常條件下和鹽脅迫下都沒有表達，因此對除VrDof20外的40個基因表達情況進行分析。從圖4中可以看出，不同Dof基因在鹽脅迫下的表達模式存在差異，從不同基因表達情況的聚類分析來看，同一組中的Dof基因表達模式存在一定程度的相似性。如VrDof27、VrDof8和VrDof11在系統進化分析中都劃分在B1組，而且它們在鹽脅迫下表達模式相似；VrDof35、VrDof6、VrDof15和VrDof22同屬于D1組成員，也有相似的表達模式；C2.2組的3個成員VrDof5、VrDof24和VrDof36表達模式相似。

CK：正常生長條件；T6：NaCl脅迫6 h；T12：NaCl脅迫12 h；T24：NaCl脅迫24 h

3 討 論

本研究從綠豆轉錄組數據庫中共篩選到41條完整的綠豆Dof家族蛋白用于生物信息學分析。目前在擬南芥和水稻中分別鑒定出Dof家族蛋白36和30條、大豆78條、玉米46條、甜瓜34條、番茄34條[8-12]，而粗山羊草中只鑒定出10條[16]，說明不同物種間存在較大差異，綠豆Dof家族蛋白的數量居中。選擇擬南芥Dof家族蛋白和綠豆Dof蛋白進行系統進化分析，綠豆Dof家族蛋白的聚類結果和擬南芥相似，可以分為A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、D1和D2共8個組，較擬南芥少了C3組，這一結果與Lijavetzky等(2003)對水稻Dof家族基因系統進化分析結果相似，水稻中也沒有C3組Dof成員[8]。對綠豆Dof基因進行結構分析發現，這些Dof基因的結構相對簡單，都有1～3個外顯子和0～2個內含子，這一結果與前人對甜瓜、馬鈴薯等的研究結果相似[11, 17]，說明不同物種的Dof家族基因具有高度的保守性。結合系統進化分類來看，同一組別內的成員含有的保守基序種類、數目和排列順序相似，并且同組內的成員在基因結構上也具有較高的保守性，因此，推測它們執行相似的生物學功能。

蛋白的磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的重要機制，在細胞信號轉導過程中起著重要作用，前人的研究結果表明ERF蛋白及其它轉錄因子蛋白都可以通過磷酸化提高植物的抗逆能力[18-19]。本研究中41個蛋白含有5～28個磷酸化位點，說明每個Dof蛋白都可能被特定的蛋白激酶磷酸化，從而激活相關基因的表達。對41個蛋白的亞細胞定位進行預測，發現它們都定位于細胞核上，說明綠豆Dof蛋白都是在細胞核中對下游基因進行轉錄調控，以適應外界的環境變化。

Dof基因是植物特有的一類轉錄因子，在植物的生長發育、開花調控、應答逆境脅迫和碳氮代謝調控方面發揮重要作用[20]。在大豆中，過表達大豆GmDof11基因可以提高大豆植株的分枝數和百粒重，同時也增加了大豆籽粒的含油量及產量[21]；研究表明水稻OsDof12基因參與調控水稻植株結構的建成[22]；擬南芥AtDof4.1基因是轉錄抑制子，在擬南芥的開花和生殖器官的發育等方面起抑制作用[23]；擬南芥CDF3基因可以被高鹽、高溫和干旱等非生物脅迫誘導表達，CDF3基因的過表達可以提高擬南芥對滲透脅迫、低溫等的抗性[24]；番茄的SlCDF1-SlCDF5基因與擬南芥的CDF基因屬于同源基因，可以被鹽、干旱、低溫等非生物脅迫誘導表達，說明這些基因參與了番茄的非生物脅迫響應，而且SICDF1和SICDF3基因可以提高擬南芥植株的抗旱能力[25]。本文對綠豆Dof基因在NaCl脅迫下的表達情況進行分析，發現除了VrDof20沒有表達外，其余40個基因在正常情況和鹽脅迫條件下都有不同程度的表達，但表達模式并不相同，呈現出上調和下調兩種不同的模式，說明綠豆Dof基因響應鹽脅迫，但不同表達模式的基因對鹽脅迫的調控機制可能存在差異。

前人的研究結果表明，系統進化樹可以對不同物種中的同類基因的功能預測提供有價值的理論依據，即系統進化中聚類在同一組的基因在基因結構、蛋白的保守基序、基因的表達模式等方面都是相對保守的，因此，同組中的基因可能具有相似的生物學功能[26-27]。研究發現擬南芥A組的Dof成員AtDOF5.4/OBP4(AT5G60850)對擬南芥的細胞周期和細胞生長起負調控的作用，我們可以根據這一結果可以預測綠豆A組與AtDOF5.4同源性高的基因在細胞周期和細胞生長方面的生物學功能[28]。擬南芥ATDOF5.8(AT5G66940)屬于D2組成員，對鹽和干旱脅迫有明顯響應，過量表達ATDOF5.8提高了擬南芥對非生物脅迫的抗性[29]，而綠豆D2組成員VrDof16可以響應鹽脅迫，推測VrDof16可能對非生物脅迫有抗性，但需通過進一步實驗來驗證。