枯草芽孢桿菌BEST195的碳水化合物酶類(CAZymes)的分布與進化分析

祝友朋，韓長志

(西南林業大學生物多樣性保護學院/云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

【研究意義】近些年，學術界關于植物病原真菌[1]、卵菌[2]、細菌[3]中碳水化合物活性酶類(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZymes)的研究已涉及預測、遺傳關系分析、蛋白互作等[3-4]以及在植物與病原菌互作過程中的功能等領域[5]，并呈現出較快的增長趨勢[6]。枯草芽孢桿菌BEST195作為納豆菌的一種，是納豆生產中重要的工業菌株之一，CAZymes蛋白影響著納豆的產量，但尚不清楚枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes的情況。【前人研究進展】有關CAZymes形成CAZy數據庫(http://www.cazy.org/)[7]，主要涉及以下6大類，糖苷水解酶(GHs)、糖基轉移酶(GTs)、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)、輔助酶類家族(AAs)以及碳水化合物綁定結構(CBMs)[6]。CAZy數據庫是專業描述碳水化合物功能域相關酶的數據庫[7-8]，為開展細菌中CAZymes的注釋與聚類分析提供了基礎[9]。到目前為止該數據庫中GH、GT、PL、CE、AA、CBM類別的家族數量分別為167、110、40、17、16、86個，其數量相比之前均有一定的增加。枯草芽孢桿菌BEST195(Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195)是日本三菱化學生命研究所從納豆中分離到的枯草芽孢桿菌納豆亞種[10]，主要產生多聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid, γPGA)[11]，然后將大豆發酵為納豆。目前，國內外學者對納豆菌的研究集中在代謝產物納豆激酶[12]、抗菌作用[13]等方面，細菌分泌蛋白的研究主要有香蕉細菌性軟腐病菌[14]、茄青枯病菌[15]、丁香假單胞桿菌番茄致病變種[16]等植物病原細菌及枯草芽孢桿菌XF-1生防菌[17]等。【本研究切入點】前人根據枯草芽孢桿菌BEST195的全基因組序列[18-19]與其他枯草芽孢桿菌菌株進行比較基因組分析，發現γPGA的產生與鞭毛蛋白FliF有直接關系[11]，且CAZymes影響著γPGA的產量，進而影響著納豆的產量。【擬解決的關鍵問題】前期通過分泌蛋白的預測明確枯草芽孢桿菌BEST195含有102個分泌蛋白[20]，然而，尚不清楚該菌中CAZymes的情況。利用在線工具CAT(CAZymes Analysis Toolkit)進行預測，網址為(http://cricket.ornl.gov/cgi-bin/cat.cgi)[9]，同時對上述CAZymes進行遺傳關系及相互作用分析，為今后研究枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes在納豆發酵時的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

首先，利用CAT[9]對前期獲得枯草芽孢桿菌BEST195的102個分泌蛋白[18]開展CAZymes預測，獲得CAZymes，然后對CAZymes進行遺傳關系分析，先利用ClustalX[21]進行多重比對，隨后利用MEGA 7.0[22]采用鄰近法構建系統發育樹[23]；最后，利用STRING v.10[24]開展蛋白相互作用預測，明確CAZymes蛋白之間的相互關系。

2 結果與分析

2.1 CAZymes的預測分析

枯草芽孢桿菌BEST195中含有57個CAZymes，其中尤以GH最多，數量為27個，所占比例為47.37%；其次是CBM，為21個，所占比例為36.84%；PL、CE、GT的數量分別為4、2、1，所占比例分別為7.02%、3.51%、1.75%。同時，該菌中僅含有一種復合型酶類，即GH/CBM，數量為2個，所占比例為3.51%(圖1)。

圖1 枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes的分布情況

2.2 GH的數量

進一步分析57個CAZymes中的糖基水解酶蛋白，共有14種，其中GH23數量最多，為6個；其次是GH18，數量為5個，上述蛋白所占比例為40.74%；再次，還涉及GH3、GH47、GH53、GH73等類型，數量均為2個，所占比例合計為29.63%(圖2)。此外，還包括GH1、GH13、GH16、GH19、GH30、GH32、GH46、GH102等類型(圖2)。

圖2 枯草芽孢桿菌BEST195中糖基水解酶蛋白的分布情況

2.3 CBM的數量

碳水化合物綁定結構蛋白含有CBM5、CBM9、CBM12、CBM13、CBM32、CBM50、CBM57、CBM66共8種類型，其中CBM50的數量最多，為11個，所占比例為52.38%；其次是CBM5，數量為3個，再次是CBM32，數量為2個(圖3)，其他5種類型CBM的數量均為1個。

圖3 枯草芽孢桿菌BEST195中碳水化合物綁定結構蛋白的分布情況

2.4 PL、CE和GT的數量

多糖裂解酶含有PL1、PL3、PL9、PL11共4種類型，數量均為1個，其ID分別是gi|428278239、gi|428281087、gi|428281263、gi|674709029；碳水化合物酯酶含有CE4、CE12此2種類型，數量均為1個，其ID分別為gi|428278282、gi|428281562；糖基轉移酶僅有GT2這1個，其ID為gi|428279498。

2.5 復合型CAZymes的數量

在所有CAZymes中，發現了2個復合類型：GH102/CBM50、GH32/CBM66，其ID分別為gi|428279554、gi|428280145。

2.6 CAZymes的遺傳關系分析

通過對上述CAZymes的遺傳關系進行分析，明確存在GH/PL/CBM、GH/CBM、GH/CBM/CE/PL、GH/CBM/CE/PL/GT等類型，但前期所預測的復合類型僅涉及GH102/CBM50、GH32/CBM66 2類，還有GH/PL/CBM、GH/CBM/CE/PL、GH/CBM/CE/PL/GT 3類未能預測(圖4)。對上述3大類進行分析，明確上述類別中均含有GH、CBM、PL，還有部分CE、GT也存在其中。此外，對于GH/CBM類別，可以很清楚的發現，存在2個重要的分支，并未聚在一起(圖4)，其原因有待進一步通過試驗進行驗證。

圖4 枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes之間的遺傳關系分析

2.7 CAZymes蛋白的相互關系分析

利用STRING v.10[22]分析枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes蛋白的相互作用網絡，發現數據庫中尚缺少枯草芽孢桿菌BEST195的有關數據，利用同源比對方式，以枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)中同源蛋白進行后續研究，發現大部分CAZymes蛋白已經明確其結構特征(圖5中大球)，因此，為今后進一步開展大多數CAZymes功能分析及相互作用關系研究提供了重要的理論支撐。另外，yvnB(YP_005562834.1)、yngK(YP_005561221.1)、yfhK(YP_005560079.1)、yckB(YP_005559509.1)、ybbC(YP_005559318.1)、lytB(YP_005562902.1)、tcyA(YP_005559538.1)、yurO(YP_005561206.1)、yvbX(YP_005560187.1)、yocH(YP_005561289.1)、wapA(YP_005563320.2)等蛋白，其結構特征尚未明確(圖5)，但在與其他已知關系蛋白中，發揮著重要的作用。

圖5 枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes蛋白的相互關系分析

3 討 論

一般而言，CAZymes是植物病原真菌、細菌中非常重要的一類蛋白，在其生長發育過程中有著不可或缺的作用[3-4,25]。但有關非植物病原菌CAZymes的研究報道較少[26-27]。枯草芽孢桿菌BEST195的分泌蛋白依據CAT網站獲得其CAZymes，是否能完全預測枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes，需要后續進行驗證。另外，前人所開展CAZymes的具體類別有5個，分別是GH、GT、PL、CE、CBM，而根據最新的分類類別，有6個，分別是GH、GT、PL、CE、AA、CBM，這是CAZymes最新分類方面的報道。

前期通過分泌蛋白預測和CAZymes預測得到枯草芽孢桿菌XF-1的分泌蛋白的數量為104個，CAZymes的數量為58個，其中26個GH、21個CBM以及2個CE、3個PL、2個GT、4個GH/CBM，枯草芽孢桿菌BEST195的分泌蛋白的數量為102個，CAZymes的數量為57個。2個枯草芽孢桿菌菌株間的分泌蛋白數量和CAZymes數量較為相近，但CAZymes的種類存在一定的差異，主要表現為枯草芽孢桿菌BEST195含有GH1、GH16、GH30、CBM13、PL9、PL11、GT39，主要功能為分解木聚糖、葡聚糖、甘露糖和鼠李糖等，枯草芽孢桿菌XF-1含有GH43、GH68、CBM26、CBM63、GH3/CBM50、GH13/CBM26，主要功能為分解木糖、蔗糖、淀粉和纖維素等。枯草芽孢桿菌BEST195作為納豆發酵菌，其作用為產生γPGA，進而將大豆發酵成納豆，枯草芽孢桿菌XF-1作為生防菌，其作用為抑制病原菌生長，誘導植物產生抗病性和促進植物生長，菌株發揮的作用與CAZymes的種類差異息息相關。但造成CAZymes的種類差異是否與菌株的生長環境及其發揮的作用有關有待于驗證。

通過對枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes開展遺傳關系分析以及蛋白相互關系分析，明確CAZymes的分類有待于向更細、更小的方向進行，前人分析也有相同結果[25]，同時，對于CAZymes蛋白之間的互作關系有待明確。

4 結 論

利用CAT進行預測，明確枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes的數量為57個，分別為27個GH、21個CBM、2個CE、4個PL、1個GT和2個GH/CBM。同時，對上述CAZymes開展了遺傳關系分析及蛋白之間互作研究，明確CAZymes蛋白之間具有相互作用的關系。為枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes的功能分析以及彼此之間相互作用研究打下了堅實的理論基礎。