外源NO和ABA處理對馬鈴薯塊莖創傷周皮中軟木脂積累的影響

張梅花，楊 芳，馬 露，宋嘉馳，申亞桐

(云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本植物，具有較強的適應性，且產量較高，富含多種營養物質，可用作多種產品的加工原料，是重要的糧菜兼用及經濟性作物之一。全球每年生產馬鈴薯近4億t，與小麥、水稻、玉米統稱為世界4大糧食作物[1-2]。隨著中國馬鈴薯產業的快速發展，目前中國已成為世界馬鈴薯第一生產大國，馬鈴薯種植面積和產量均占世界的 1/4[3]，居于首位。馬鈴薯作為中國重要的糧食作物，分布廣，可周年生產，經濟效益好，對于保證中國食物安全、促進貧困地區脫貧增收和地區經濟振興崛起意義重大[4]。但是，馬鈴薯塊莖在收獲、運輸和儲藏等過程中均易受到各類機械損傷，若不及時修復，會造成含水量下降，并且為病原的侵染提供了路徑，增加感病率，加速馬鈴薯塊莖品質的退化，造成嚴重的經濟損失[5]。因此，如何加速薯塊創傷后的愈合成為一個亟待解決的問題。【前人研究進展】塊莖損傷或受到外界壓力時，損傷細胞會釋放多種信號，刺激產生各種保護性或創傷誘導的反應，其中就包括木栓化[6-7]。木栓化的組織能夠將薯塊內部組織與外界環境隔離開，抑制水分的快速散失和病原菌的進一步侵染。軟木脂是塊莖創傷后木栓化過程中合成的重要物質。研究發現損傷愈合和受環境脅迫的組織中，如因非生物脅迫和微生物侵染等造成損傷的部位含有大量的軟木脂。軟木脂是由甘油、脂肪酸與酚類化合物形成的高分子雜聚物，它可以控制水分和溶質的流出，在植物抵抗環境脅迫和病原微生物侵染等脅迫過程中發揮重要作用[8]。硝普酸鈉(sodium nitroprusside，SNP)是“自發”的一氧化氮(nitric oxide，NO)供體，在水溶液溶解中就可釋放NO。2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5，-四甲基-1，3-二氧咪唑啉鉀鹽(Carboxy-PTIO potassium salt，cPTIO)為NO專用清除劑，廣泛用于消除植物中NO的累積。是植物發育和病理生理過程中必不可少的信號分子和調節分子。在植物生長發育過程中，NO在抵御各種生物和非生物脅迫中發揮著不同的生理作用。Pari′s等研究證明NO參與了馬鈴薯葉片的傷口愈合反應，誘導細胞壁葡聚糖的沉積，并且對創面細胞胼胝質的累積有促進作用，創傷相關基因如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase，PAL)、伸展蛋白的表達經SNP處理呈現轉錄水平上調，增加的NO水平可能增強植物的愈合反應，加快受損組織的恢復[9]。PAL是軟木脂形成過程中所需木質素合成的關鍵酶，其轉錄水平的上升可能暗示NO與創傷后軟木脂的累積有關聯。脫落酸(Abscisic acid，ABA)是植物體內重要的激素，它能抑制植物生長發育和細胞分裂、伸長，同時也促進脫落、衰老和休眠，調節氣孔開閉，提高植物的抗逆性，是一種重要的脅迫激素[10]。研究表明ABA能提高植物對干旱和高溫等非生物脅迫的抗性，它通過調節氣孔的開閉以及小分子有機化合物的積累，降低水勢，維持較高的滲透壓，從而抑制水分的散失[11-13]。Cottle等用ABA處理馬鈴薯培養細胞發現ABA能使軟木脂生物合成過程中軟木脂、蠟質的積累增加[14]。此外，ABA 處理能促進塊莖愈傷閉合層的形成和愈傷周皮的成熟，木質素和閉合層細胞聯接成矩形網狀結構，增加細胞壁強度和厚度[15]。【本研究切入點】影響薯塊創傷后愈合的因素有很多，主要包括內部因素和外部因素兩方面，內部因素包括品種和生理年齡等，外部因素主要包括溫度、濕度、創傷程度和外源化學試劑等。由于不同的因素使得塊莖創傷愈合的效果和速率及形成軟木脂的成分存在較大差異，其中外源NO和ABA具有提高植物抗逆性和形成愈傷的重要作用，但目前有關二者協同原生周皮在調節不同品種馬鈴薯薯塊創傷后軟木脂積累方面的研究較少。【擬解決的關鍵問題】采用2個不同品種的馬鈴薯來探討外源NO和ABA以及原生周皮對薯塊創傷后軟木脂積累的影響，進一步豐富薯塊創傷后的愈合機制，同時為加快馬鈴薯創傷愈合的方法提供理論支撐和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯品種“網紋108”和“滇薯47號”(分別以“W108”和“D47”表示)由云南農業大學薯類研究所提供。“W108”薯塊橢圓形，薯皮白色，薯肉黃色，薯塊表面呈網紋狀開裂；“D47”薯塊圓形，薯皮白色，薯肉白色，薯塊表面光滑。采收時挑選形態、大小一致，薯皮完整，無機械損傷、無病蟲害的塊莖，裝入塑料網袋，每袋約10 kg。采后于常溫下放置14 d后儲存在2～8 ℃條件下的冷庫內。實驗前從倉庫取出后在常溫條件下平衡2 d，再進行后續實驗。

1.2 實驗方法

將準備好的馬鈴薯用清水將薯皮洗凈，每個品種挑選40個馬鈴薯，將馬鈴薯分成兩等份，一份去除原周皮，一份保留。后將每個馬鈴薯用刀平均切成8等份(10～15 g)，用純水將薯塊表面游離的淀粉顆粒洗去，以切面為創面。NO和ABA處理濃度均通過前期試驗進行篩選。實驗共分為5個試劑處理：對照(超純水，CK)；處理1(1 mmol·L-1SNP)；處理2(2 mmol·L-1SNP)；處理3(0.13 mmol·L-1cPTIO)；處理4(0.1 mmol·L-1ABA)。

將切好的馬鈴薯小塊分成5等份分別放入5個處理燒杯中浸泡1 h，每20 min更換一次處理液。處理后用定性濾紙將傷口表面的處理液除去，整齊放在覆蓋有保鮮薄膜的磁盤上，放置在溫度為22 ℃，相對濕度為90%的恒溫恒濕培養箱中進行創傷愈合。在塊莖創傷后24、72、120和168 h隨機取樣，進行切片染色觀察。實驗共重復3次。

軟木脂的積累觀察參考LuLai等的方法并修改[16]。每個處理隨機選取3個薯塊，用不銹鋼刀片將愈傷塊莖垂直于創面切成厚 0.2～0.3 mm的切片，蒸餾水洗去切片表面的淀粉顆粒，用0.05%的甲苯胺藍染液染色60 min，染色過程中每10 min輕微震蕩一次，以使染色均勻。后分別用75%乙醇和超純水脫染3次。脫染后再用0.1%中性紅染液復染90 s，再用75%乙醇和超純水分別脫染3次，將脫染后的切片放于載玻片上制成臨時水封片，于熒光顯微鏡(型號:Leica MD 3000)下觀察，記錄拍照。用軟件LAS Version 4.6.2測量有明顯熒光的組織厚度(圖1)。

A：保留原周皮的塊莖創面；B：去除原周皮的塊莖創面；C：左為保留原周皮的塊莖，右為去除原周皮后的塊莖

1.3 數據統計與分析

數據分析采用SAS 9.3計算機程序包(SAS Institute Inc.，Cary，NC)的通用線性模型(GLM)程序進行分析。文中顯示的數據均取3個數字的統計平均值，統計顯著性為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同試劑處理對馬鈴薯塊莖創傷周皮中軟木脂積累的影響

由表1可知，試劑、處理時間以及二者互作效應對2個品種馬鈴薯去皮和不去皮薯塊軟木脂積累均有顯著性影響(P<0.05)。

表1 試劑、時間以及二者互作效應對2個品種馬鈴薯薯塊軟木脂積累影響的方差分析

由圖2可知，馬鈴薯塊莖創傷后24 h時均未觀察到軟木脂累積，至72 h在塊莖創面下約2～3層細胞可觀察到軟木脂累積，之后各處理的軟木脂積累隨著時間的延長均呈現整體增加的趨勢，總體表現為前72 h快速增加，隨后增長減緩。

A：“W108”不去皮薯塊軟木脂的積累；B：“W108”去皮薯塊軟木脂的積累；C：“D47”不去皮薯塊軟木脂的積累；D：“D47”去皮薯塊軟木脂的積累。圖中比例尺為200 μm

2.1.1 不同試劑處理對“W108 ”創傷周皮中軟木脂積累的影響 表3-A表明，“W108”不去皮塊莖在創傷愈合期間，ABA處理、SNP處理較CK均表現出顯著促進軟木脂累積，cPTIO處理對塊莖軟木脂積累具有抑制作用，并在72和168 h較CK表現為顯著性抑制作用。ABA處理在創傷后至120 h軟木脂累積優與其他處理，后期增長變緩，在168 h軟木脂厚度與120 h比較僅增長10.35%，而2 mmol·L-1SNP處理在創傷168 h后軟木脂厚度為569.31 μm，與120 h比較增長了45.38%，比同期的ABA處理高6.49%。

表3-C表明，“W108”去皮塊莖在創傷愈合期間，ABA和SNP處理較CK均表現出顯著促進軟木脂累積。ABA處理在120 h軟木脂快速累積，在各處理中累積厚度最大(565.893 μm)，相比24 h增長142.47%，之后增長幅度變緩，在168 h累積厚度為597.18 μm，比120 h僅增長5.53%；2 mmol·L-1SNP處理始終保持較快的增長，其72 h的軟木脂厚度(294.18 μm)在各處理中最高，比ABA處理高26.05%，在創傷168 h，2 mmol·L-1SNP處理軟木脂積累最高(639.41 μm)。在創傷愈合期間cPTIO處理軟木脂累積最少，在處理前期cPTIO處理值較CK沒有顯著性差異，但在168 h時表現出顯著性抑制。

2.1.2 不同試劑處理對“D47”創傷周皮中軟木脂積累的影響 由圖3-B可知，“D47”不去皮塊莖在創傷愈合期間，ABA處理較快促進軟木脂的累積，其72 h的軟木脂累積厚度為311.05 μm，比2 mmol·L-1SNP處理高12.98%，較CK高42.88%。2 mmol·L-1SNP處理在創傷72 h后軟木脂快速累積，其168 h的軟木脂累積厚度為512.47 μm，較同時間ABA處理高6.60%。在處理72～168 h內，2 mmol·L-1SNP和ABA處理較CK呈顯著促進作用；1 mmol·L-1SNP處理值較CK高，二者在120～168 h差異顯著；創傷期間cPTIO處理的軟木脂積累最低，較CK對薯塊軟木脂積累具有顯著的抑制作用。

由圖3-D可知，“D47”去皮塊莖在創傷愈合期間，ABA處理較快促進軟木脂的累積，在72 h軟木脂累積厚度為306.73 μm，比2 mmol·L-1SNP處理高20.72%，較CK高68.62%，之后軟木脂積累保持緩慢增長，在168 h軟木脂增長27.52%。而2 mmol·L-1SNP處理在創傷72 h后軟木脂快速累積，在168 h軟木脂累積厚度為454.52 μm，高于其余各處理，與72 h相比軟木脂增長78.89%。在處理72～168 h期間，SNP和ABA處理較CK呈顯著促進作用。在處理168 h后，cPTIO處理的軟木脂積累最低，但與CK無顯著差異。

A：“W108”不去皮薯塊軟木脂的積累厚度；B：“D47”不去皮薯塊軟木脂的積累厚度；C：“W108”去皮薯塊軟木脂的積累厚度；D：“D47”去皮薯塊軟木脂的積累厚度。大寫字母表示同一時間不同試劑處理的差異顯著性(P<0.05)，小寫字母表示同一試劑處理下不同時間的差異顯著性(P<0.05)，誤差線為平均值±標準差

2.1.3 不同試劑處理對馬鈴薯塊莖創傷周皮中軟木脂積累速率的影響 在24～120 h內，塊莖創傷周皮中軟木脂累積厚度的增長速率依次為ABA>2 mmol·L-1SNP>1 mmol·L-1SNP>CK>cPTIO，其中24～72 h內增長速率范圍為2.53～7.43 μm·h-1，72～120 h內增長速率范圍為0.10～6.93 μm·h-1；在120～168 h，整體增長速率依次為2 mmol·L-1SNP>ABA>CK>1 mmol·L-1SNP>cPTIO，增長速率范圍為2.54～11.28 μm·h-1。

2.2 馬鈴薯品種和原生周皮對塊莖創傷周皮中軟木脂積累的影響

由表2可知，在相同時間、相同試劑和相同去皮處理下，2個品種馬鈴薯薯塊軟木脂的累積有顯著性差異(P<0.05)；在相同時間、相同試劑和相同品種下，去除原周皮對塊莖創傷周皮中軟木脂的累積有顯著影響(P<0.05)。

表2 試劑、時間、品種、去皮、不去皮以及它們互作效應對薯塊軟木脂積累的方差分析

2.2.1 馬鈴薯品種對塊莖創傷周皮中軟木脂積累的影響 圖4表明，對不同品種塊莖去皮后用相同試劑處理，結果表明1 mmol·L-1SNP，2 mmol·L-1SNP，cPTIO，CK 4種處理下，“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，在120 h時差異最大，分別比“D47”高出47.62%，63.45%，52.46%，74.88%；ABA處理后“W108”的軟木脂累積在120～168 h內顯著高于“D47”，而在72 h時“D47”的累積顯著高于“W108”，以120 h差異最大，高出81.56%。

對不同品種的塊莖保留原周皮后用相同試劑處理，試驗結果表明“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”。CK處理在72～120 h時2品種軟木脂累積無顯著差異，在處理168 h時，“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，高出17.52%；1 mmol·L-1SNP處理在72 h時2個品種軟木脂的累積無顯著差異，在120～168 h時“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，以168 h時差異最大，高出26.37%；2 mmol·L-1SNP

處理在72和168 h時，“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，以168 h差異最大，高出26.37%，在120 h時兩品種無顯著差異；ABA處理在72～168 h內“W108”的軟木脂累積均顯著高于“D47”，以120 h時差異最大，高出23.24%；cPTIO處理后，在72和168 h時2個品種軟木脂累積均沒有顯著差異，而在120 h時“W108”的累積極顯著高于“D47”，高出17.95%。

2.2.2 原生周皮對塊莖創傷周皮中軟木脂積累的影響 由圖4可知，不同試劑處理 “W108”結果表明，去皮的薯塊軟木脂累積均顯著高于不去皮的薯塊。在1 mmol·L-1SNP、2 mmol·L-1SNP、ABA、CK和cPTIO試劑處理后在120 h時差異最大，去皮薯塊的軟木脂分別比不去皮薯塊的軟木脂厚度增加31.15%，31.98%；34.81%，32.35%，36.13%；不同試劑處理 “D47”結果表明，CK處理不去皮薯塊軟木脂的累積均顯著高于去皮薯塊；2 mmol·L-1SNP和ABA處理，在72 h時去皮和不去皮薯塊軟木脂累積無顯著差異，在120～168 h內不去皮的軟木脂累積顯著高于去皮薯塊，在120 h時差異最大，分別比去皮薯塊高出26.54%，26.12%；cPTIO試劑處理后，在72～168 h內去皮和不去皮薯塊軟木脂累積均無顯著差異。

A：CK；B：處理1(1 mmol·L-1 SNP)；C：處理2(2 mmol·L-1 SNP)；D：處理4(0.1 mmol·L-1 ABA)；E：處理3(0.13 mmol·L-1 cPTIO)。字母表示同一培養時間下的顯著差異性(P<0.05)，誤差線為平均值±標準差

3 討 論

NO在抵抗生物和非生物脅迫中發揮著重要的生理作用。研究表明，NO對馬鈴薯創傷后軟木脂的累積有促進作用，而不同濃度的SNP處理對軟木脂累積促進效果不同，無論是累積厚度還是累積速率，2 mmol·L-1SNP效果均較1 mmol·L-1SNP 好。研究中SNP促進塊莖創傷周皮中軟木脂的快速累積，進而加塊傷口愈合，與Pari′s等研究證明NO參與了馬鈴薯葉片的傷口愈合反應的結論一致[9]。同時，cPTIO處理后軟木脂的累積被抑制，進一步印證了NO參與了創傷周皮中軟木脂的累積。

ABA是植物體內重要的脅迫激素之一，對植物抗脅迫反應至關重要。研究表明，ABA能顯著促進薯塊軟木脂的累積，Cottle 等[14]和李雪等[15]的研究也有類似結果。2 mmol·L-1SNP和ABA都能促進薯塊創傷后軟木脂的積累，但2種試劑的響應并不完全一致，ABA在前期(72 h)較好，而2 mmol·L-1SNP是在后期(168 h)響應較高。

NO作為信號分子與ABA調控植物生理生化作用有很多聯系，Scuffi等研究證實NO產生受ABA誘導，并作為ABA的下游信號分子誘導調控氣孔關閉[17]。Freschi等[18]研究認為在幼小的鳳梨中，NO被認為是ABA上調景天酸代謝信號通路中的關鍵組分。研究中呈現ABA和NO的響應高效時間的不一致，是否與2種試劑的內在偶聯有關還有待探討。

薯塊創傷后的愈合能力受多種因素影響，品種差異就是內因之一。不同品種塊莖的創傷應激能力不同，Lulai等研究表明黃褐皮基因型比紅皮基因型塊莖的愈傷周皮成熟快[20]。Baritelle等[19]則認為高比重的塊莖有較低的損傷閾值，損傷抗性較低。研究中，2個供試品種在薯塊的肉色、原生周皮、抗病性等方面都存在差異，受創后“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，說明2個馬鈴薯品種創傷愈合能力有差異，與前人研究一致。

此外，研究結果表明，軟木脂的累積受原周皮的影響，但效應因品種而異，“D47”不去皮的薯塊軟木脂累積更多，而“W108”去皮的薯塊軟木脂累積更多。

4 結 論

研究顯示外源NO和ABA處理對薯塊創傷后軟木脂的累積有顯著影響，表明外源NO和ABA處理可有效促進馬鈴薯創傷愈合過程。1 mmol·L-1SNP、2 mmol·L-1SNP和ABA均能促進軟木脂的積累，2 mmol·L-1SNP的促進效果較1 mmol·L-1SNP好。不同品種間軟木脂的累積存在顯著差異，“W108”軟木脂的累積顯著高于“D47”。另外，去除原周皮對薯塊軟木脂的累積有影響，但在2個品種中呈現的效應和趨勢不一致，在多數情況下，“D47”不去原周皮的薯塊軟木脂累積更多，而“W108”則去除原周皮的累積更多。