燕麥SCoT分子標記體系的優化及引物篩選

李 進，陳仕勇

(1.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；3.四川省抗逆牧草種質創新及生態修復工程實驗室，四川 成都 610041)

【研究意義】燕麥(AvenasativaL.)是世界各地廣泛種植的一種重要的一年生糧飼兼用作物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優良性狀和較高的營養及保健價值[1]。燕麥主要分布在北半球的溫帶地區，國內主要種植省區為河北、內蒙古、山西，其次是甘肅、寧夏、陜西、青海及四川等，特別在我國青藏高原地區是冬春重要的飼草來源[2]。目標起始密碼子多態性(start codon targeted polymorphism, SCoT)分子標記是一種針對ATG起始密碼子及側翼序列保守性開發的新型目的基因分子標記，該技術較其他分子標記具備操作簡便、多態性高、遺傳穩定性好和成本低等優勢。通過優化建立燕麥SCoT-PCR反應的最優體系，為SCoT分子標記技術在燕麥中的應用以及燕麥品種的保護、新品種的選育等提供重要的工具。【前人研究進展】國內對于燕麥的研究主要集中在高產栽培管理技術研究、抗性生理研究[3]、遺傳育種研究[4-5]等。目前，隨著分子遺傳標記技術的廣泛應用，已有多種分子標記技術在燕麥種質資源評價及育種中應用。如基于內部簡單重復序列(ISSR)[6]、隨機擴增多態性 DNA 標記(RAPD)[7]、相關序列擴增多態性標記(SRAP)[8]等分子標記技術揭示了燕麥種質資源間的遺傳變異，但不同的分子標記手段都有各自的優缺點并能達到互補的作用[9]。自Collard和Mackill[10]開發了SCoT分子標記以來，已有多種植物的 SCoT-PCR反應體系被建立或優化[11]。目前已在牧草和飼用作物上得到了較好的應用，如紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、鴨茅(DactylisglomerateL.)等[12]。【本研究切入點】目前燕麥種質資源的評價和育種落后于其他栽培作物，特別是關于種質的評價和精準鑒定等方面，因此開展不同類型的分子標記在燕麥種質資源研究中非常有必要。本研究采用正交試驗設計方法對SCoT-PCR反應體系進行優化，并篩選了80條SCoT引物在供試燕麥中進行多態性篩選和退火溫度的確定。【擬解決的關鍵問題】建立燕麥SCoT-PCR反應的最優體系，篩選出在不同燕麥品種中擴增多態性較好的引物，并確定其最佳的退火溫度，為燕麥SCoT分子標記技術的應用提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選用青引1號、青引2號、蘇聯燕麥、青燕1號4個品種進行PCR體系優化和引物篩選，本研究中的供試材料種子均來自四川省抗逆牧草種質創新及生態修復實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 將供試燕麥種子于花盆中播種，待燕麥幼苗長出后，隨機采集每個品種不少于20株的鮮嫩葉片混合，采用試劑盒DP305(北京天根)提取DNA，用Nanodrop測定其DNA濃度和純度，并用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，模板DNA保存在-30 ℃的冰箱冷凍備用。

1.2.2 SCoT-PCR退火溫度的確定與目標引物的篩選 本研究引物選用Collard和Mackill[10](SCoT1～SCoT36) 及Luo等[13](SCoT37～SCoT80)開發的SCoT引物，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR擴增反應在BIO-RAD T100 Termal Cycler PCR儀上進行，擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；退火1 min(設置8個退火溫度梯度分別為54、53.5、52.8、51.7、50.3、49.1、48.4、48 ℃)；72 ℃延伸1.5 min；共34個循環；72 ℃延伸10 min；最后置于4 ℃冰箱冷藏備用。擴增反應結束后采用 1.3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，拍照保存并分析各個引物擴增效果。

1.2.3 SCoT-PCR的正交試驗設計 在引物退火溫度篩選的基礎上，隨機選取引物用于確定適宜的2×EsTaqMaster Mix(北京康為世紀生物)、DNA模板與引物的用量，反應中各個因素水平如表1所示，L9(33)正交設計具體信息如表2所示，試驗所用樣本DNA濃度為10 ng·μl-1，引物濃度為10 μmol·μl-1。

表1 燕麥SCoT-PCR反應體系各因素水平

表2 PCR反應因素水平的L9(33)正交設計方案

1.2.4 SCoT-PCR擴增 PCR反應體系總體積為20 μl，不足部分用ddH2O補足，將反應產物在1.3 %瓊脂糖凝膠上進行檢測，選用D2000作為電泳Marker。對各體系擴增效果進行對比，以選取最佳反應體系。

1.2.5 反應體系的驗證 以四川省抗逆牧草種質創新及生態修復實驗室栽培的其他12個品種燕麥DNA為模板(隴燕3號、隴燕4號、隴燕5號、燕王、駿馬、牧王、鋒利、邊鋒、牧樂思、領袖、夢龍、莫妮卡)，隨機選取能擴增出清晰可辨且完整條帶的引物驗證反應體系的可靠性及退火溫度的準確性，并用1.3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗結果。

2 結果與分析

2.1 退火溫度篩選

引物退火溫度是影響PCR反應的重要因素，在前期實驗的基礎上本試驗確定了在48～54 ℃退火溫度范圍進行最佳溫度的篩選。在不同退火溫度條件下，引物的擴增效果存在一定的差異(圖1)，主要表現在條帶數量、亮度及清晰程度等方面。這也說明有必要對篩選的引物進行退火溫度的優化。SCoT57引物的退火溫度篩選中，當退火溫度設置為51.7 ℃時，擴增條帶清晰且完整，而退火溫度小于或大于51.7 ℃時擴增出來的條帶不夠清晰和完整。

2.2 引物篩選

本試驗選用4個供試燕麥品種對80條SCoT引物的擴增效果及多態性進行了篩選和評價。其中65條引物能擴增出清晰可辨且完整的條帶，占供試引物的81.25 %，每條引物擴增條帶數為2～14條，其中36條引物能擴增出清晰且豐富的多態性條帶(表3)，占供試引物的45 %。

表3 SCoT引物序列

續表3 Continued table 3

2.3 燕麥SCoT反應體系的正交試驗分析

不同正交組合處理的擴增效果存在差異(圖2)，如主帶的亮度、擴增條帶的清晰程度等。處理5的擴增條帶數量和清晰程度等最佳，同時結合試劑用量等因素，確定最優的反應體系：2 μl模板DNA(10 ng·μl-1)、2 μl引物(10 μmol·L-1)、9 μl Mix混合液和7 μl ddH2O。

2.4 反應體系穩定性的驗證

應用優化后的燕麥SCoT-PCR反應體系，選取引物SCoT48對實驗室的其他12個燕麥品種DNA進行擴增，不同燕麥品種擴增產物均清晰穩定(圖3)，體現出了品種之間的差異，表明該體系能夠進行穩定的PCR擴增，適合用于不同燕麥品種的SCoT-PCR分析及燕麥屬飼用植物的研究。

3 討 論

SCoT標記是一種基于翻譯起始位點的目標分子標記新技術，具有操作簡單、引物通用性高、多態性高、成本低且重復性好等優點[14]。其與較多的基因形成了較多的引物結合位點，且其擴增的不確定性介于外顯子與內含子之間，大幅度提升了該引物的多態性[15]。與其它分子標記手段相比，SCoT標記技術與供試材料的功能基因相關，更能反應相關功能性狀的多態性[16]，是適用于農作物、水果和牧草等植物種質資源鑒定、保護和利用、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種、基因定位和克隆等研究的非常有效的一種分子標記[17]。本研究首次將SCoT分子標記技術應用于燕麥，通過本研究最終得到燕麥SCoT-PCR反應的最佳體系，且在其他燕麥品種中進行了驗證，最終均能獲得清晰穩定的擴增產物，為今后SCoT分子標記技術在燕麥上的應用奠定了理論基礎。

準確應用SCoT分子標記技術的前提是首先要建立一個高效、穩定的SCoT-PCR反應體系。SCoT-PCR反應受多個因素的影響。退火溫度是PCR擴增程序中的重要影響因素，本試驗中各引物退火溫度有較大區別主要集中在51.7～53.5 ℃，這與之前研究所用的退火溫度不同。如韓國輝等[13]優化了柑橘SCoT分子標記適宜的退火溫度，所有引物退火溫度均為49 ℃；李強等[18]優化了大豆SCoT分子標記適宜的退火溫度，引物最佳退火溫度為50.4 ℃。導致該現象的原因可能是由于不同研究所用的試驗材料及反應條件不一致，同時也驗證了袁王俊等[19]的觀點，表明不同的反應條件與材料導致退火溫度不一致。因此，進行退火溫度的優化可確保分子標記的準確性和擴增條帶的特異性，達到理想的擴增效果。目前PCR主要采用是Mix反應混合液，其將PCR主要成分TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs預先進行混合，并加入穩定劑等成分使得PCR操作簡便和穩定。本研究中采用2×TaqMaster Mix，在篩選多態性引物的同時進行各個引物退火溫度的確定，共設置了8個梯度與4個重復，以此來確保各引物最佳退火溫度的準確性，使復雜的試驗流程簡單化，易于操作。

4 結 論

在燕麥SCoT-PCR反應體系(20 μl)中，最優的組合為2 μl模板DNA(10 ng·μl-1)、2 μl引物(10 μmol·μl-1)、9 μl Mix混合液和7 μl ddH2O。