大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物脅迫表達分析

邱 爽，張 軍，何佳琦，周雨明，李銘楊，翟 瑩*

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.吉林中智九方咨詢有限公司，吉林 長春 130000)

【研究意義】植物在遭受不良環境條件后，可以誘導合成大量滲透調節物質來增加植物細胞的滲透壓，提高植物抵抗脅迫的能力，從而維持植物自身的代謝和生長發育。其中棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides, RFOs)就是這些滲透調節物質的典型代表，它們是高等植物中含量僅次于蔗糖的一類可溶性糖。肌醇半乳糖苷合成酶(Galactinol synthase, GolS)是RFOs生物合成途徑中的關鍵酶[1]。大豆作為一種重要的經濟作物，其GolS基因的功能鑒定對于大豆RFOs代謝途徑及大豆抗逆機制的研究都具有重要意義。【前人研究進展】目前已有大量關于GolS基因受逆境脅迫誘導表達的報道，且超量或異源表達該基因可以不同程度的提高轉基因植物的抗逆性。擬南芥中含有7種GolS基因，其中AtGolS1和AtGolS2可以被干旱和高鹽脅迫誘導上調表達，AtGolS3可以被低溫脅迫誘導上調表達[2]。AtGolS1與AtGolS2過表達轉基因植株中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量均增加，對氧化脅迫的耐受能力增強[3]。將AtGolS2在水稻中異源表達還可以提高轉基因水稻在干旱脅迫下的產量[4]。小麥TaGolS3的表達受外源脫落酸、低溫和鹽脅迫的誘導，同時還能被ZnCl2和CuCl2所誘導，通過對活性氧的調控，轉基因植株表現出對鋅脅迫的耐受性[5]。GolS基因表達的調控機制較為復雜，目前已發現多種植物轉錄因子可以調控其表達，例如HSF、DREB和WRKY等[6-8]。但到目前為止，有關大豆中肌醇半乳糖苷合成酶的研究非常少見。【本研究切入點】本研究克隆了一個大豆GolS基因GmGolS，并對其非生物脅迫下的表達量進行檢測?！緮M解決的關鍵問題】此研究為GmGolS基因在大豆抗逆基因工程育種中的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 基因的克隆

在NCBI(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)中獲得一個功能未被鑒定的大豆GolS基因mRNA序列(Genebank登錄號：NM001251098)。使用RNAiso Plus試劑(Takara)提取大豆葉片總RNA，使用cDNA反轉錄試劑盒(Novoprotein)合成第一鏈cDNA。根據GmGolS基因開放閱讀框(ORF)序列設計引物，上游引物為5′-GGAATTCCATATGATGGCTCCTAATATCACCACTG-3′，下游引物為5′-GGAATTCTTAAGCAGCAGATGGGGC-3′(其中下劃線部分分別代表限制性內切酶位點NdeI和EcoR I)，以第一鏈cDNA為模板擴增基因的全長ORF序列。PCR反應程序設置為94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步驟進行30個循環；72 ℃延伸8 min。PCR擴增產物連接至克隆載體pMD18-T(Takara)并轉化大腸桿菌DH5α。挑取陽性菌落擴繁并提取質粒，經NdeI 和EcoR I對質粒進行雙酶切，陽性質粒送上海生工公司測序鑒定。

1.2 生物信息學分析

蛋白的分子量和等電點使用在線軟件ExPASy(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)進行預測；蛋白的亞細胞定位使用在線軟件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行預測；在NCBI數據庫(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)搜索植物GolS基因；蛋白系統進化樹使用MEGA5.0軟件進行構建。

1.3 非生物脅迫處理

在25 ℃培養室內，配制Hoagland營養液水培大豆幼苗，光照條件為16 h光照/8 h黑暗。待大豆幼苗的第一片三出復葉完全展開時，進行非生物脅迫處理：將大豆幼苗置于含15 % PEG8000的營養液中模擬干旱脅迫；將大豆幼苗置于含150 mmol/L NaCl的營養液中進行高鹽脅迫；將大豆幼苗置于4 ℃培養箱中進行低溫脅迫。分別在處理的0(即未處理)、1 、2 、5 、10 和 24 h 剪取0.1 g 第一片三出復葉，迅速置于液氮中，-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.4 實時熒光定量PCR

使用RNAiso Plus試劑(Takara)提取上述各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280值檢測提取的RNA質量。使用cDNA反轉錄試劑盒(Novoprotein)合成第一鏈cDNA。根據GmGolS基因ORF序列設計實時熒光定量PCR引物。上游引物為5′-TCTAAGCCTTGGAGGTACACTGG-3′，下游引物為5′-GGCACGGACGAACTTGACTTC-3′。選擇大豆組成型表達基因β-Tubuin(GenBank登錄號：GMU12286)作為內參基因(F：5′-GGAAGGCT TTCTTGCATTGGTA-3′，R：5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上，對GmGolS基因在非生物脅迫下的表達量進行檢測。實時熒光定量PCR反應體系如下：2×TB Green Premix ExTaqⅡ(Takara) 10 μl、cDNA 2 μl、上下游引物各0.8 μl，補水至20 μl。反應程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40個循環。所有處理均做3次重復，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 GmGolS基因的克隆

如圖1所示，從大豆葉片cDNA中擴增獲得一條大約1000 bp的條帶，與NCBI數據庫中公布的GmGolS基因序列(987 bp)大小相符合。將其連接克隆載體pMD18-T(圖1)，經測序驗證，擴增所得產物正是GmGolS基因。

2.2 GmGolS序列及進化分析

由圖2顯示，GmGolS基因ORF全長987 bp，編碼328個氨基酸，分子量38.03 kDa，等電點5.79。GmGolS蛋白含有一個保守的錳離子結合序列DXD，一個相對保守的絲氨酸磷酸化位點及一個C末端疏水性的五肽結構APSAA，這些都是植物GolS的典型特征[10-11]。亞細胞定位預測結果顯示，GmGolS蛋白定位于細胞的葉綠體和/或細胞質中。

將GmGolS蛋白氨基酸序列與其他植物中的13個GolS蛋白氨基酸序列進行進化分析。由圖3顯示，GmGolS蛋白與沙冬青AmGolS蛋白的親緣關系最近，其次與玉米ZmGolS1蛋白也具有比較近的親緣關系，與擬南芥AtGolS蛋白和小麥TaGolS蛋白的親緣關系最遠。

2.3 GmGolS在非生物脅迫下的表達

大豆幼苗經干旱、高鹽和低溫脅迫處理后，利用實時熒光定量PCR對GmGolS的表達動態進行檢測。結果顯示：干旱處理后，GmGolS被誘導表達且響應最為明顯，在處理后2 h 達到最大值，是對照0 h的155倍(圖4-A)；高鹽和低溫處理后，GmGolS也被誘導表達，但表達量的升高均不超過對照的10倍(圖4-B和4-C)。由此推測GmGolS可能主要在大豆應對干旱脅迫時發揮功能。

3 討 論

RFOs代謝途徑與植物生長發育及植物抗逆性之間關系密切。GolS是RFOs生物合成起始的關鍵限速酶，它通過催化UDP-半乳糖和肌醇反應合成肌醇半乳糖苷，再以此為供體，在棉籽糖合成酶和水蘇糖合成酶的作用下將蔗糖合成棉籽糖和水蘇糖等寡糖[12]。這些可溶性糖不僅可以作為細胞中的滲透調節物質，還可以作為植物適應環境的信號物質[13]。

GolS屬于多基因家族，僅在擬南芥中就發現了10個編碼GolS的基因[14]，大豆中也含有多個GolS基因(后續會另文發表)。不同GolS基因在植物應對脅迫時的功能不盡相同[2, 15]，即不同的GolS基因可以被不同的逆境條件所誘導，同一逆境又可以同時誘導多種GolS基因的表達，所以不同的GolS基因的抗逆性也存在交叉[16]。但不同物種間的GolS具有很高的相似性，它們都具有一個對于GolS酶活至關重要的錳離子結合序列DXD[17]，一個相對保守的絲氨酸磷酸化位點及一個C末端疏水性的五肽結構APSAA。亞細胞定位的不同可能意味基因功能上會存在差異。GmGolS蛋白可能定位于葉綠體和/或細胞質中，這與前人研究結果相符[18]。

基因表達量檢測結果顯示，GmGolS對干旱脅迫的應答要明顯強于對高鹽和低溫脅迫的應答，是一個典型的干旱誘導型基因，推測其可能在大豆抗旱生理中起到重要作用。前人也報道了大量GolS提高轉基因植物抗旱性的研究。例如在水稻中超表達擬南芥AtGolS2使轉基因水稻耐旱能力顯著提高[4]；在煙草中超表達牛耳草BhGolS1同樣使轉基因植株耐旱能力顯著提高[19]。玉米ZmGolS2受干旱脅迫誘導且能提高轉基因擬南芥的耐旱性，研究發現其啟動子上存在2個脫水響應元件DRE，ZmDREB2A可以與其中一個DRE元件結合從而上調ZmGolS2的表達[20]。而本研究中的GmGolS基因上游是否也存在轉錄因子的調控，其具體的調控機制如何，還有待進一步研究。

4 結 論

本研究從大豆中擴增得到編碼GolS的基因GmGolS。其ORF全長987 bp，編碼328個氨基酸，分子量38.03 kDa。GmGolS蛋白與沙冬青AmGolS蛋白的親緣關系最近。干旱、高鹽和低溫脅迫均可誘導GmGolS的表達，且GmGolS對干旱脅迫的響應最為明顯。