文拉法辛對抑郁模型大鼠抑郁癥狀的改善作用及對海馬組織PI3K/Akt/mTORC1信號通路的影響

白天山，李志榕，黃 平，徐 燁，柳文華

近年來，伴隨著人們生活節奏加快和生活壓力增加，抑郁癥已成為臨床常見的情感障礙類精神疾病，嚴重影響人們的日常生活和身心健康[1]。研究顯示，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)與抑郁、癲癇、阿爾茨海默病等多種神經系統疾病有關[2]，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)及蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)為mTOR上游中最主要的調控蛋白，并且提高PI3K/Akt/mTOR信號通路中Akt活性，可以有效地防止神經元程序性死亡[3-4]。文拉法辛(Wenfalasin)為5-羥色胺(5-HT)及去甲腎上腺素(NE)再攝取雙重抑制藥，是一種臨床常用新型抗抑郁藥物，目前對于其抗抑郁作用機制尚未完全闡明[5]。本研究擬建立孤養結合慢性刺激(CUMS)抑郁大鼠模型，觀察文拉法辛對抑郁大鼠抑郁癥狀的改善作用效果及對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響，以期闡明文拉法辛抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(SPF)級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，7～8周齡，體質量 200～225 g，購自北京維通利華生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2018-2-006。

1.2 藥品與試劑 鹽酸文拉法辛片(批號：100203)，規格：每片25 mg，購自常州四藥制藥有限公司。白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定試劑盒購自美國R&D公司。兔抗鼠PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)單克隆抗體購自美國Abcam公司，mTOR及磷酸化mTOR(p-mTOR)單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin內參及二抗購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 儀器 RIPA裂解液及BCA試劑盒購自美國Thermo公司；Morris水迷宮購自西班牙Panlab公司；組織切片機購自美國Thermo公司；BIO-R40型電泳槽及Kodak2000MM型電泳凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad公司；CX23光學顯微鏡購自日本Olympus公司；Eoipse Ti-s型倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 抑郁大鼠模型建立、分組及處理 60只健康雄性SD大鼠適應性喂養1周，隨機分為對照組、模型組及文拉法辛低劑量組、文拉法辛中劑量組、文拉法辛高劑量組，每組12只。模型組與文拉法辛各劑量組大鼠均參照文獻[6]方法以孤養結合慢性輕度不可預見刺激構建抑郁癥大鼠模型，對照組正常飼養。主要應激包括：禁食禁水24 h、束縛3 h、夾尾1 min、電擊足底(1 mA，20 s/min，30 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、熱烘(45 ℃，5 min)、強光頻閃3 h，除對照組外，其余各組大鼠每天隨機給予1～2種不同刺激，連續刺激21 d，以出現飲水量顯著降低、體質量減輕、毛色晦暗、探索行為減少等抑郁癥狀為建立模型成功。建模后文拉法辛低、中、高劑量組分別灌服15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的文拉法辛，每日1次，對照組及模型組灌服等量的生理鹽水，均連續給藥3周。末次給藥結束后1 h對所有大鼠進行行為學測試，完成后立即取材。

1.4.2 大鼠行為學觀察

1.4.2.1 體質量 各組大鼠于試驗結束后分別稱量記錄體質量。

1.4.2.2 曠場試驗 各組大鼠于給藥結束后進行曠場試驗。按照文獻[7]方法，在室內安靜狀態下，記錄4 min內大鼠水平運動的格數及垂直豎立的次數(水平運動格數為大鼠穿越底面塊數，垂直豎立次數為兩前肢離開地面直立次數)，計算水平和垂直得分的總和即為其自主活動次數。

1.4.2.3 糖水偏好實驗 各組大鼠于給藥結束后分別進行基礎糖水/純水消耗試驗。按照文獻[8]方法，在適應性訓練后，每只大鼠給予1瓶1%蔗糖水及1瓶純水，1 h后記錄大鼠總液體消耗量和糖水消耗量，糖水偏愛率(%)=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.4.3 大鼠學習與記憶功能 各組大鼠分別于給藥結束后，采用Morris水迷宮測試檢測其學習與記憶功能。按照文獻[9]方法，分別對各組大鼠進行定位航行實驗及空間探索實驗，分別記錄各組大鼠的逃避潛伏期時間(latency time)及目標象限記憶時間(memory time)。

1.4.4 海馬神經元尼氏染色觀察大鼠海馬病理改變情況 各組大鼠分別于實驗取材結束后，分離全腦并采用4%多聚甲醛溶液固定48 h，參考文獻[10]的方法，切取大腦視交叉平面至橫裂腦組織，隨后進行常規脫水和石蠟包埋，切片后進行尼氏染色，光學顯微鏡下觀察海馬組織中尼氏小體及CA3區神經元。

1.4.5 ELISA檢測海馬組織中炎性因子的變化 實驗結束后，各組大鼠均以斷頭法處死，采集其腦部海馬區組織，準確稱取各組大鼠海馬組織，參考文獻[11]的方法，于組織中加入預冷生理鹽水并超聲粉碎，4 ℃、5 000 g離心15 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后，嚴格按照IL-6、IL-1β及TNF-α的ELISA測定試劑盒說明書操作步驟檢測上述炎性因子的含量。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測海馬組織PI3K/Akt/mTORC1信號通路相關蛋白的變化 取上述1.4.5中各組大鼠剩余的海馬組織，參考文獻[12]的方法，制備組織勻漿液，提取組織總蛋白，4 ℃、5 000 g離心20 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量。隨后常規上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳，經轉膜、封閉，隨后加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR及β-actin一抗(1∶1 000)、辣根過氧化物酶標志兔抗鼠二抗(1∶2 000)，化學底物發光法顯色，圖像掃描分析，采用 Image-QuaNT軟件測量其光密度，以各β-actin為內參對照分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠抑郁行為比較 與對照組比較，模型組大鼠體質量、糖水偏愛率及自主活動次數均明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，文拉法辛中劑量組、高劑量組體質量、糖水偏愛率及自主活動次數均明顯升高(P<0.05)，文拉法辛低劑量組糖水偏愛率及自主活動次數明顯升高(P<0.05)，但體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明文拉法辛能明顯改善抑郁大鼠的抑郁行為學特征。詳見表1。

表1 各組大鼠抑郁行為比較 (±s)

2.2 各組大鼠學習及記憶能力比較 與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期時間明顯增加，目標象限記憶時間明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，文拉法辛各劑量組逃避潛伏期時間明顯降低，目標象限記憶時間明顯延長(P<0.05)，表明文拉法辛能改善抑郁大鼠的學習記憶能力。詳見表2。

表2 各組大鼠學習及記憶能力比較(±s) 單位：s

2.3 各組大鼠海馬組織尼氏染色結果 尼氏染色結果顯示，對照組大鼠海馬組織CA3區錐體細胞形態規則，排列緊密有序，并且胞漿內尼氏小體豐富。模型組大鼠海馬CA3區錐體細胞形態不規則，排列疏松紊亂，神經元數量明顯減少，并且細胞胞漿尼氏小體淺染甚至消失；在給予不同劑量的文拉法辛后，大鼠海馬CA3區錐體細胞形態及神經元損傷均得到一定程度的改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織尼氏染色結果(×400)

2.4 各組大鼠海馬組織炎性因子含量比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6及TNF-α含量均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，文拉法辛中劑量組、高劑量組IL-1β、IL-6及TNF-α含量均明顯降低(P<0.05)，文拉法辛低劑量組IL-6及TNF-α含量明顯降低(P<0.05)，但IL-1β含量差異無統計學意義(P>0.05)，表明文拉法辛能降低抑郁大鼠海馬組織中的炎性因子含量。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬炎性因子含量比較 (±s) 單位：pg/mg

2.5 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt/mTORC1通路蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中PI3K、Akt、mTOR磷酸化蛋白與總蛋白比值均明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，文拉法辛中劑量組、高劑量組PI3K、Akt、mTOR磷酸化蛋白與總蛋白比值均明顯增加(P<0.05)，文拉法辛低劑量組PI3K、mTOR磷酸化蛋白與總蛋白比值增加(P<0.05)，但Akt磷酸化蛋白與總蛋白比值差異無統計學意義(P>0.05)，表明文拉法辛能激活PI3K/Akt/mTORC1通路，上調相關通路蛋白的表達。詳見圖2、表4。

圖2 各組大鼠海馬組織中PI3K/Akt/mTORC1信號通路相關蛋白表達電泳圖

表4 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt/mTORC1通路蛋白相對表達量比較(±s)

3 討 論

抑郁癥為一類常見的精神障礙性疾病，臨床主要表現為情緒低落、行為遲緩、學習記憶下降、快感缺失、體質量減輕等癥狀，其發病機制至今未完全明確[13-14]。研究顯示，長期慢性精神應激性刺激與抑郁癥的發病密切相關，長期的慢性應激可引起腦部海馬神經元的萎縮變性或死亡[15]。本研究結果顯示，文拉法辛能明顯改善慢性應激抑郁模型大鼠海馬CA3區錐體細胞形態及神經元損傷，促進海馬神經元細胞的數量增加，提高神經元的可塑性。曠場試驗主要反映大鼠對新環境的探究情緒，表明其對環境的興奮性和自主性；糖水實驗主要反映大鼠對快感的缺失程度；Morris水迷宮實驗利用大鼠厭水的天性來評價其學習記憶能力[16]。本研究結果顯示，文拉法辛能改善抑郁模型大鼠體質量、糖水偏愛率及自主活動次數，降低逃避潛伏期及延長目標象限記憶時間，表明文拉法辛能夠提高抑郁大鼠對周圍事物的興趣，增加進食量，改善學習記憶能力。

有研究發現，抑郁癥病人外周和中樞的炎性細胞因子增多會導致免疫病理損害加強[17]，并且中樞神經遞質代謝紊亂與中樞細胞因子紊亂有一定相關性[18]，表明文拉法辛改善海馬組織的病理損傷可能與調節海馬組織中炎性細胞因子有關。本研究結果顯示，文拉法辛能明顯降低模型組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6及TNF-α含量，表明大鼠在接受慢性應激刺激時誘導了免疫應答，促使炎性因子的分泌，文拉法辛能夠改善抑郁大鼠因神經遞質下降而導致細胞因子分泌異常的情況。

PI3K/Akt/mTORC1信號通路廣泛存在于真核細胞中，mTORC1活性對于神經元的生長、分化和發育是必不可少的，抑制mTORC1通路活性可降低神經細胞活性，誘導神經元損傷[19]。研究顯示，慢性不可預知性應激可導致大鼠海馬組織中mTOR和Akt磷酸化蛋白表達下調，同時mTORC1信號通路缺陷易導致抑郁癥的發生[20]。本研究結果顯示，文拉法辛能上調PI3K、Akt、mTOR磷酸化蛋白與總蛋白比值，表明文拉法辛對PI3K/Akt/mTORC1信號通路具有明顯的激活作用。

綜上所述，文拉法辛可通過上調PI3K/Akt/mTORC1信號通路，減輕神經細胞凋亡，促進神經蛋白合成，誘導神經再生，改善神經元存活率，從而發揮顯著的抗抑郁效果。