脂聯素通過Nrf2/HO-1通路對急性心肌梗死大鼠心功能和心肌細胞凋亡的作用機制

郭施勉，楚英杰

冠狀動脈急性閉塞導致的心肌缺血在臨床中被稱為急性心肌梗死(AMI)[1-3]，通常病人臨床癥狀為心源性休克、心律失常，嚴重者可出現猝死。AMI重要病理環節是心肌缺血缺氧、氧化應激反應過度激活，這一過程中包括很多生物學環節，而過度激活核因子E2相關因子2(Nrf2)/血紅素氧化酶1(HO-1)通路就是心肌缺血缺氧、氧化應激反應過度的表現之一[4-6]。Nrf2/HO-1通路參與了細胞內抗氧化應激的信號通路，在一定條件下，使Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1和Nrf2結合受到抑制。在過度激活氧化應激的條件下，氧自由基可以調控Nrf2蛋白表達增多和Keap1解離，從而調控HO-1基因序列上的啟動基因和抗氧化反應元件表達并發揮抗氧化的影響。脂聯素(APN)是一種內源性激素，是由脂肪細胞分泌的一種具有促進脂肪和葡萄糖分解代謝功能的蛋白質[6-8]，其對降低胰島素抵抗、提高機體胰島素敏感度有著積極的作用。有研究證明，在胰島素抵抗狀態的作用下，葡萄糖分解代謝功能出現障礙，導致心肌細胞脂肪酸氧化失常，心肌細胞凋亡率急劇增加，這時會出現心臟收縮障礙[9-11]。盡管近年來有很多研究均證實了APN與心肌細胞凋亡有相關性，但是APN是否通過干擾Nrf2/HO-1通路對AMI病人心肌細胞凋亡起作用及其作用機制鮮見報道。本研究旨在探討APN通過Nrf2/HO-1通路對AMI大鼠心功能和心肌細胞凋亡的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠購自廣東省醫學實驗動物中心；鋅原卟啉 9(ZPP-Ⅸ)購自Meilunbio；原位末端標記測定法(TUNEL)染色試劑盒及磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自美國 Biomiga公司；第一鏈 cDNA合成試劑盒和RNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Nrf2、HO-1、B淋巴細胞瘤 2 蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關 X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)的一抗購自Santa Cruz公司；凝膠成像儀和PCR儀購自Bio-Rad 公司；熒光顯微鏡購自Nikon公司；分光光度計購自上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 將健康成年雄性SD大鼠隨機分為Sham 組、AMI組、APN組和APN+ZPP-Ⅸ組，Sham 組不做任何處理，AMI組、APN組和APN+ZPP-Ⅸ組均建立AMI模型(方法：左冠狀動脈前降支結扎)。

1.2.2 建模 腹腔注射10%水合氯醛10 mL/kg麻醉后將大鼠仰臥放置于手術操作臺，在大鼠的左側第3肋、第4肋間作切口，切開后顯露心臟，然后分離左冠狀動脈前降支，縫合左冠狀動脈前降支的起始部位，然后關閉腹腔，建模成功。

1.2.3 給藥方法 建模后，APN組給予腹腔注射1mg/(kg·d)APN，APN+ZPP-Ⅸ組給予腹腔注射1 mg/(kg·d)APN和10 μmol/(kg·d) ZPP-Ⅸ，Sham 組和AMI組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，連續注射7 d。

1.2.4 心臟氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 最后1次給藥24 h后，在Sham 組、AMI組、APN組和APN+ZPP-Ⅸ組各選擇2只大鼠，摘取其心臟后放入-20 ℃的環境下冰凍，1 h后取出，沿著心臟長軸以心尖向心室基底部開始橫向切心肌組織5片，將5片心肌組織使用1% TTC進行染色，20 min后使用4%多聚甲醛固定10 min。拍照，灰白色為缺血心肌組織，紅色為正常心肌組織，使用Image J 軟件分析心肌缺血面積。

1.2.5 血清心肌酶檢測 建模24 h后，取大鼠的眼內眥血液，然后將其靜置30 min后進行離心處理，取上清液，使用分光光度試劑盒檢測LDH、CK-MB、CK含量。

1.2.6 心肌細胞凋亡檢測 最后1次給藥24 h后，解剖大鼠心臟，將梗死的心肌組織分離，使用4%多聚甲醛固定后實施石蠟包埋，將心肌組織制成切片后使用TUNEL試劑盒進行染色。在顯微鏡下藍色熒光為細胞核，綠色熒光為凋亡細胞，計算心肌細胞凋亡率。

1.2.7 mRNA表達水平檢測 獲取梗死的心肌組織，使用RNA提取試劑盒將梗死心肌組織的RNA進行分離，然后將RNA合成cDNA。在擴增條件下，使用熒光定量PCR試劑盒進行cDNA擴增，連續循環40次，得出循環閾值。用β-actin作內參，根據循環閾值計算mRNA的表達水平。

1.2.8 基因蛋白表達檢測 將RIPA裂解液放入梗死部位心肌組織中，提取梗死部位心肌組織總蛋白后實施定量。每組蛋白選擇50 μg，然后使用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測。在聚丙烯酰胺凝膠中加入蛋白樣本進行電泳和電轉膜后加入5%的脫脂牛奶，將其放入溫室中培養2 h，取出使用TBST進行洗膜，連續清洗3遍。將Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3的一抗加入。在4 ℃條件下培養12 h后，使用TBST進行洗膜，連續清洗3遍，放入溫室中培養2 h，使用凝膠成像儀得到蛋白條帶，用β-actin作內參，根據蛋白條帶計算基因蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 4組大鼠血清心肌酶含量比較 Sham 組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯低于AMI組，AMI組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯高于APN組，APN組LDH、CK-MB、CK含量明顯低于APN+ZPP-Ⅸ組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠血清心肌酶含量比較(±s) 單位：U/L

2.2 4組大鼠缺血心肌面積比較 與Sham 組比較，AMI組大鼠明顯有心肌缺血，且APN組大鼠心肌缺血面積明顯小于AMI組，APN+ZPP-Ⅸ組大鼠心肌缺血面積明顯大于APN組。詳見圖1。

圖1 心肌組織TTC染色圖

2.3 4組大鼠心肌細胞凋亡率比較 AMI組心肌細胞凋亡率明顯高于Sham 組，APN組心肌細胞凋亡率明顯低于AMI組，APN+ZPP-Ⅸ組心肌細胞凋亡率明顯高于APN組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

2.4 4組大鼠心肌組織中凋亡基因mRNA及蛋白表達水平比較 AMI組心肌中Bcl-2表達明顯低于Sham組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達明顯高于Sham組；APN組心肌中Bcl-2表達明顯高于AMI組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達明顯低于AMI組；APN+ZPP-Ⅸ組心肌中Bcl-2表達明顯低于APN組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達明顯高于APN組；差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

2.5 4組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1表達水平比較 AMI組心肌中Nrf2、HO-1表達水平明顯高于Sham組，APN組心肌中Nrf2、HO-1表達水平明顯高于AMI組，差異均有統計學意義(P<0.05)；APN+ZPP-Ⅸ組心肌中Nrf2表達水平與APN組比較差異無統計學意義(P>0.05)，APN+ZPP-Ⅸ組心肌中HO-1表達水平明顯低于APN組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6、圖7。

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

與Sham組比較，＊ P<0.05；與AMI組比較，# P<0.05；與APN組比較，△ P<0.05。

3 討 論

AMI是臨床中最為嚴重的冠心病[12-14]。近年來AMI病人逐年遞增，具有較高的發病率和死亡率，嚴重影響人們的生命安全。AMI病理基礎是不穩定斑塊破裂，其始動原因為血管內皮細胞受損，而血管內皮細胞受損主要標志就是血管內皮細胞蛋白C受體[15-17]。APN是一種新型內源性生物蛋白質，其具有抗炎癥、抗動脈粥樣硬化和抗損傷后內膜增生的活性[18]。相關報道指出，APN與冠心病等心血管疾病的發生、發展有一定的相關性[19]。近年來，APN在心血管疾病發病過程中的影響已成為研究熱點。舒海洲等[20]研究發現，APN與AMI的發生發展有關，且APN還能影響AMI的預后。

本研究將APN運用到AMI治療中，通過建立AMI大鼠模型，檢測血清心肌酶水平的變化，結果發現，Sham 組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯低于AMI組，AMI組血清LDH、CK-MB、CK含量明顯高于APN組，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明APN對于減輕心肌損傷程度有積極的作用。

AMI發生后心肌細胞出現損傷是線粒體途徑細胞凋亡的重要環節，隨著抗凋亡分子Bcl-2不斷減少，促凋亡分子Bax逐漸增多，導致線粒體內的細胞色素C大量進入細胞質，通過相關反應使Pro-caspase-3被裂解成Cleaved-caspase-3促使細胞凋亡。本研究發現，AMI組心肌中Bcl-2表達明顯低于Sham組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達明顯高于Sham組，差異均有統計學意義(P<0.05)，進一步說明在AMI大鼠中線粒體途徑細胞凋亡被過度激活，造成Bcl-2表達水平過低，Cleaved-caspase-3和Bax表達水平明顯升高。吳霞等[21]研究發現，APN在心肌細胞中具有抗凋亡的作用。本研究將APN用于AMI模型大鼠中，結果發現，APN組大鼠心肌中Bcl-2表達明顯高于AMI組，且Cleaved-caspase-3和Bax表達明顯低于AMI組，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明APN可以抑制AMI大鼠細胞凋亡。

有相關報道指出，在AMI細胞凋亡發生和發展過程中受到炎癥介質、缺血缺氧、氧自由基等多種病理因子的調控，在缺血缺氧的條件下Nrf2/HO-1通路在心肌中發揮了重要的調控作用[22-23]。本研究發現，AMI組大鼠心肌中Nrf2、HO-1表達水平明顯高于Sham組，APN組大鼠心肌中Nrf2、HO-1表達水平明顯高于AMI組，差異均有統計學意義(P<0.05)。說明APN可以有效刺激Nrf2/HO-1通路起到抗氧化、抗凋亡的作用。為了進一步證實APN是否通過Nrf2/HO-1通路對心肌起保護作用，本研究采用抑制ZPP-Ⅸ來抑制APN對Nrf2/HO-1通路的激活作用，結果發現，APN組LDH、CK-MB、CK、心肌細胞凋亡率、心肌中Bax和Cleaved-caspase表達水平明顯低于APN+ZPP-Ⅸ組，差異均有統計學意義(P<0.05)；APN組心肌中的Bcl-2表達水平明顯高于APN+ZPP-Ⅸ組，差異有統計學意義(P<0.05)，證明APN通過刺激Nrf2/HO-1通路來對AMI大鼠心肌起保護作用。

綜上所述，APN在AMI模型大鼠中具有抑制心肌細胞凋亡、減輕心肌受損的作用，APN保護心肌作用的分子機制為Nrf2/HO-1通路。