飼料中三種聚醚類藥物殘留檢測的改進方法

杜 楊，杜 磊，孟 佳

（1.安陽市畜產品質量安全監測檢驗中心，河南 安陽 455000；2.安陽工學院 生物與食品工程學院，河南 安陽 455000）

聚醚類抗生素（Polyether antibiotics，PEs）是20世紀70年代左右開始投放市場的、具有離子載體性質的一類抗生素。比較常見的聚醚類藥物包括鹽霉素（Salinomycin，SAL）、莫能菌素（Monensin，MON）、拉沙菌素（Lasalocid，LAS）、那拉菌素（Narasin，NAR）、山度霉素（Semduramicin，SEM）、馬杜霉素（Maduramicin，MAD）等。這類抗生素普遍具有促進離子穿過細胞膜的能力，對雞常見的球蟲病具有較好的防治效果。此外，其在雞的飼料報酬及增重方面的效果優于傳統抗球蟲藥氨丙啉和氯羥吡啶，因此被廣泛用于養雞業[1]。但由于其具有較強的細胞毒性，添加過量會造成藥物殘留，因此用藥的安全范圍非常窄[2]。肉制品的藥物殘留能夠通過食物鏈嚴重影響人類健康[1]。因此，聚醚類藥物殘留量的檢測技術研究，對保障畜禽產品質量安全有著十分重要的意義。原農業部《關于發布<藥物飼料添加劑品種目錄及使用規范>的公告》中規定了甲基鹽霉素、鹽霉素及莫能菌素可以作為藥物飼料添加劑使用，同時也規定了其使用方法和添加量。

聚醚類抗生素的殘留分析方法主要包括微生物檢測法、分光光度法、色譜法（薄層層析法、高效液相色譜、液相色譜—串聯質譜法）及免疫學方法[3]。本文參照《原農業部1862號公告-4-2012 飼料中5種聚醚類藥物的測定 液相色譜—串聯質譜法》[4]，給出了一種更為合理省時的改進方法，在保證檢驗結果準確可靠的前提下，把前處理操作過程化繁為簡，既縮短了前處理的時間，又減小了前處理過程中可能產生的系統誤差，給飼料中鹽霉素、甲基鹽霉素及莫能菌素3種聚醚類藥物殘留的檢測檢驗工作效率帶來了極大提升。

1 材料與方法

1.1 耗材與試劑

試驗中所用水為GB/T 6682中規定的一級水，所用試劑均為分析純，乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純；正己烷；乙醚；二氯甲烷；乙醚一正己烷（50∶50）：乙醚、正己烷按體積比1∶1混勻；二氯甲烷一甲醇（90∶10）：二氯甲烷、甲醇按體積比9 ∶1 混勻；甲基鹽霉素（Narasin，NAR）≥97%，鹽霉素（Salinomycin，SAL）≥98%，莫能菌素(Monensin，MON)≥90%；硅膠固相萃取柱，500 mg/3 ml。

1.2 儀器及設備

液相色譜一串聯質譜儀：配有電噴霧電離源；組織勻漿機；渦動儀；氮吹儀；離心機；天平：感量0.01 g；分析天平：感量0.000 01 g；振蕩器；固相萃取裝置；0.2 μm有機濾膜；移液器：100 μl、1 000 μl。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜 色譜柱：C18（1.7 μm，2.1*100 mm），或其他效果等同的C18柱；進樣量：10.0 μl；流速：0.3 ml/min；柱溫：25±5℃；流動相：0.1%甲酸/甲醇溶液。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質譜 離子源：ESI；掃描方式：ES+；電離電壓：3.9 kV；源溫度：150℃；霧化溫度：500℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：7.00 bar；溶劑氣流速：1 000 L/h；碰撞氣流速：0.17 ml/min。

1.4 檢測方法

1.4.1 儲備液及工作液配制 步驟1：分別稱取3種標準品約10 mg于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到1 000 μg/ml3種標準溶液（-20℃，12個月）。步驟2：分別取步驟1標準溶液各1 ml于100 ml容量瓶中，甲醇定容，得到10 μg/ml混合標準液（-20℃，6個月）。步驟3：分別取步驟2混合標準液各1 ml于200 ml容量瓶中，用乙腈（0.1%甲酸）定容，得到50 ng/ml標準中間液。步驟4：分別取步驟3標準中間液各1 ml于10 ml量瓶中，用乙腈（0.1%甲酸）定容，得到5 ng/ml標準工作液。

1.4.2 陽性對照制備 取1 000 ng/ml中間液（把步驟2配置溶液稀釋10倍得到1 000 ng/ml中間液）100 μl加入空白樣品中，即得添加濃度為50 ng/g的陽性對照。

1.4.3 提取 稱取試樣2 g（±0.01 g）于50 ml離心管中，加20 ml乙腈，渦旋震蕩提取約30 min，離心5 min，轉速6 000 r/min，準確移取上清液2 ml于10 ml尖底離心管中，60℃氮吹，加入3 ml正己烷溶解殘渣（轉速由低到高，小心調節不要造成溶液飛濺，2 000 r/min左右），備用。

1.4.4 凈化 取硅膠固相萃取柱，加3 ml正己烷預洗，備用液過柱，加乙醚—正己烷10 ml于備用液的離心管中，洗滌，擠干，加二氯甲烷—甲醇5 ml于備用液的離心管中，在固相萃取裝置中放入洗脫架、離心管，洗脫并收集洗脫液，擠干，60℃氮氣吹干，用乙腈（含0.1%甲酸）2.0 ml復溶（轉速由低到高，小心調節不要造成溶液飛濺，2 000 r/min左右）過0.2 μm濾膜后，供液相色譜一串聯質譜儀檢測。

1.4.5 定量方法 采用基質單點校正法，試樣中聚醚類藥物的含量為X，以質量分數微克每千克（μg/kg）表示，殘留量計算公式如下所示。

式中，A為供試試料溶液中聚醚類藥物峰面積，AS為標準品溶液中聚醚類藥物峰面積，CS為標準溶液濃度（ng/ml），V為定容體積（ml），m為稱樣量（g），n為稀釋倍數。

2 結果與分析

本試驗在國標方法的基礎上專門針對飼料中的鹽霉素、甲基鹽霉素及莫能菌素給出了具體的前處理方法。在提取過程中，國標方法用到乙腈20 ml兩次提取轉移，合并兩次提取液后用旋蒸儀蒸干，5 ml正己烷復溶后再離心。相對于國標方法本試驗方法提取液僅用乙腈20 ml提取一次，并取上清液2 ml經氮吹儀吹干，復溶液3 ml，過程操作簡易、清晰、快速、提取充分，能夠降低損失、減少有毒試劑的使用。國標方法的凈化過程使用8 ml乙醚—正己烷洗滌，6 ml二氯甲烷—甲醇洗脫。而本方法中凈化過程使用10 ml洗滌液、5 ml洗脫液，洗滌更加充分，過程損失更小，回收率達到95%～105%，重復性條件下兩個平行測定的結果相對偏差為5%（國標中規定≤15%），不同實驗室間檢測結果相對標準偏差為5.4%，3種聚醚類藥物的定量限均為10.0 μg/kg。

由此可見，本試驗改進方法相對國標方法更加準確、高效，極大地提高了工作效率；節省了耗材，減少了對人體有害試劑的使用；在減少前處理設備使用頻率的同時，也減小了試驗中產生的系統誤差，對飼料中聚醚類藥物殘留檢測工作具有重要作用。