甘肅省部分地區羔羊死亡病原調查

高生智，潘永紅*，梁 斌，詹 芳，史萬貴，李有全

（1.甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730030；2.中國農業科學院 蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730030）

2019—2020年甘肅省部分地區的羊只出現了以貧血、高熱、消瘦、出血和體表淋巴結腫大為主要特征的臨床癥狀，呈點狀散發，屬地方性動物疫病，初步懷疑為羊泰勒蟲病。為進一步了解臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣等地區羊泰勒蟲病病原感染情況，于2020年3—5月對以上4個縣患病羊只進行了羊耳尖血涂片，并采集羊血液，一一對應編號，帶回實驗室進行血液涂片染色鏡檢和羊泰勒蟲PCR檢測。對鏡檢有典型蟲體、有疑似蟲體和部分鏡檢陰性血液涂片對應的全血樣品進行羊泰勒蟲PCR檢測，結果表明：永靖縣、榆中縣、臨潭縣的羊泰勒蟲病是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合感染，而華池縣羊泰勒蟲病是單一的尤氏泰勒蟲感染，證實了臨床懷疑診斷。現將試驗總結如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血片 來自臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣，每縣90張。于羊耳尖采血推制血片，自然風干，甲醇固定，吉姆薩染色。

1.1.2 全血 來自臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣，每縣90份。于羊頸靜脈采血，搖勻，帶回實驗室凍存待檢。

1.1.3 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根公司，批號20200618。

1.1.4 普通PCR試劑 引物兩對，尤氏引物、呂氏引物；DNA聚合酶（premix Tap），DEPC水，dNTP，標準DNA（Marker），上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠，常規電泳液。

1.1.5 移液器和槍頭 2 μl、10 μl、50 μl、100 μl、200 μl、1 000 μl單道移液器，高壓滅菌配套槍頭。

1.1.6 其他 顯微鏡、生物安全柜、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統。

1.2 方法

1.2.1 血片 常規顯微鏡鏡檢。鏡檢20高倍以上野，發現5個以上典型蟲體為有典型蟲體；發現1～2個疑似蟲體為有疑似蟲體；未發現蟲體為無蟲。

1.2.2 全血 按試劑盒說明書提取DNA模板，普通PCR鑒定。

試驗成立：電泳結束后，陽性對照樣品應出現2條帶，分別為303 bp和530 bp。陰性對照無擴增條帶。否則，此次試驗視為無效。

陽性判定：如果待檢樣品擴增產物在303 bp和（或）530 bp處出現條帶，則為陽性。如出現2條帶，則判定該待檢樣品為兩種泰勒蟲陽性；如出現1條帶，則判定該待檢樣品為相對應的泰勒蟲陽性。

陰性判定：如待檢樣品無擴增條帶，判定為陰性。

2 結果

2.1 血片

如表1所示，通過檢測發現4個地區患病羊只的蟲體檢出率不同，臨潭縣最高，為68.42%，華池縣最低，為36.67%。

表1 4個地區蟲體檢出結果

2.2 全血

如表2所示，4個地區患病羊只蟲體感染率不同，除華池縣以外，其余3個縣的患病羊只都同時感染2種泰勒蟲。

表2 4個地區樣本泰勒蟲PCR檢測結果

2.3 血片對應全血

從表3中可以看出，鏡檢有蟲、PCR確認有泰勒蟲的比例為45.90%（56/122），鏡檢有蟲、PCR確認無泰勒蟲的比例為16.39%（20/122），鏡檢無蟲、PCR確認有泰勒蟲的比例為27.87%（34/122），鏡檢無蟲、PCR確認無泰勒蟲的比例為9.84%（12/122），鏡檢與PCR結果一致率為55.74%（68/122），鏡檢與PCR結果不一致率為44.26%（54/122）。

表3 4個地區樣本泰勒蟲鏡檢結果 單位：個

3 分析與討論

在華池縣檢測到尤氏泰勒蟲，在榆中縣、永靖縣、臨潭縣檢測到呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲，確認了榆中縣、永靖縣、臨潭縣羊泰勒蟲病是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合感染；華池縣羊泰勒蟲病是單一的尤氏泰勒蟲感染。調查4縣平均陽性率為44.95%，優勢蟲種為尤氏泰勒蟲，其次是呂氏泰勒蟲。

羊泰勒蟲病在甘肅分布廣泛[1-4]，各地感染率、發病率、死亡率存在明顯差異。此次鏡檢平均陽性率為62.3%（76/122），PCR平均陽性率為73.77%（90/122），鏡檢與PCR結果一致率為55.74%（68/122）。

在羊泰勒蟲病流行病學調查中，長期沿用采血涂片染色鏡檢的方法是急性發病病例確診的經典方法[1-4]，但在大規模流行病學調查時稍顯不足，尤其是紅細胞染蟲率偏低時易出現漏檢現象，血液涂片染色檢查要求操作人員熟練掌握制片技術，熟悉羊泰勒蟲、無漿體的蟲體形態和大小，否則當出現混合感染時易造成誤檢漏檢。此次4縣鏡檢誤差率為44.26%（54/122）。

國外報道的羊泰勒蟲有4個種，即萊氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、分離泰勒蟲和隱藏泰勒蟲，其中萊氏泰勒蟲具有致病性，由其引起的泰勒蟲病也稱惡性泰勒蟲病。自1958年我國四川甘孜藏族自治州報道該病以來，甘肅、青海、寧夏、陜西、遼寧、內蒙古陸續報道有該病發生[5-7]。殷宏等（2002）通過系統研究后發現，我國羊泰勒蟲病的病原并非萊氏泰勒蟲，而是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲。同時證實甘肅省夏河縣、寧縣、天祝縣羊的泰勒蟲是單一的呂氏泰勒蟲，在臨潭縣、張家川縣及青海省湟源縣的羊泰勒蟲是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合[5]。筆者再次證實了永靖縣、榆中縣、臨潭縣羊泰勒蟲是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合；華池縣羊泰勒蟲是尤氏泰勒蟲，從而得知甘肅省羊泰勒蟲病的病原是尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲。