高濃釀造啤酒發酵周期的研究進展

張亞萌，王金晶 *，鈕成拓，鄭飛云，劉春鳳，李 崎

（1.江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院 釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫 214122）

啤酒是水和茶之后世界上消耗量排名第三的飲料，由于其口感清爽、營養物質豐富，深受消費者青睞。啤酒的發展歷史悠久，并且經濟的高速崛起促進了啤酒釀造新技術的開發，其中高濃釀造技術發展最為迅速，如今已成為一項成熟技術。啤酒生產中，正常麥汁濃度為10～12°P，而高濃釀造是指使用較高濃度麥汁發酵，之后用脫氧水稀釋至所需濃度，一般高濃麥汁濃度為16～18°P，大于18°P則稱為超高濃麥汁[1]。20世紀70年代，由美國和加拿大率先推出高濃釀造啤酒，大大提高了生產效率及設備利用率，這種生產工藝在啤酒行業得到了廣泛應用。目前高濃釀造存在的問題之一是發酵周期長，高濃麥汁造成高滲透壓環境、高水平乙醇生產，從而對酵母發酵性能產生不利影響，降低發酵度及發酵速度。本文綜述了高濃釀造發酵周期的影響因素，旨在為啤酒行業解決這一問題提供理論參考。

1 高濃釀造工藝特點

高濃釀造一大工藝要點是制備高濃麥汁，一般采用兩種方法。一是在原本工藝基礎上加大投料量，但這種方式會導致糖化醪黏度升高，過濾困難，降低原料利用率，同時還會導致酒花利用率低，煮沸時間延長，增加能耗[2]。另一種方法是適當使用糖漿，在煮沸麥汁結束前加入糖漿，調整到所需的浸出物濃度，避免了上述問題且不影響麥汁質量，同時能夠降低能耗、減少麥芽用量[3]，故此方法應用更廣泛。

稀釋工藝是高濃釀造的另一要點，可以在任一生產環節進行，如麥汁冷卻后、發酵過程中、啤酒后熟期等。稀釋用水的要求很嚴格，應當無異味，具有和被稀釋啤酒相同或十分接近的溫度、pH[2]。

結合工藝來看，高濃釀造具有提高設備利用率及產量、降低能耗和成本、增加產品靈活性等諸多優點[2，4]；不可避免也存在以下問題[2，4]：①由于麥汁濃度高，糖化時原料浸出率及酒花利用率下降；②泡持性相對較差；③對啤酒酵母產生不利影響，降低酵母活力及發酵性能，致使發酵遲緩、發酵周期長；④高濃釀造啤酒稀釋后酒體偏淡，風味物質不平衡。

2 高濃釀造對發酵周期的影響

2.1 原料質量

啤酒發酵主要是依靠啤酒酵母吸收并利用麥汁中的營養物質（主要指碳源和氮源）進行繁殖，在其代謝過程中產酒精及一系列醇酯等風味物質。因此麥汁質量往往直接影響酵母的生長進而影響發酵過程。

麥汁浸出物中90%是糖類，其中可發酵性糖主要包括麥芽糖、麥芽三糖、葡萄糖，各組分比例的改變會影響酵母的代謝，如葡萄糖阻遏效應。高濃麥汁制備時一般要添加糖漿，各糖類比例也就隨原料的不同而發生變化。研究發現，高濃釀造時，與添加葡萄糖相比，添加麥芽糖可以使酵母的發酵性能更均衡，麥汁中細胞數更多，發酵力更高，同時還有利于啤酒的風味特征[5]。但是麥芽糖比例并不是越高越好，RAUTIO J J等[6]研究發現在高麥芽糖的高濃麥汁中，葡萄糖阻遏效應并不明顯，但后期酵母的麥芽糖代謝相關基因表達量會明顯下滑。此外，麥汁濃度及添加的可發酵糖甚至添加時間都會影響酵母的發酵性能[7]。麥汁中碳源對酵母的影響機制是比較復雜的，葡萄糖和麥芽糖比例過高過低都會影響酵母的發酵，而且可能由于菌株差異、麥汁濃度等具體的影響均有不同。

麥汁中游離氨基氮（free amino nitrogen，FAN）是影響酵母生長和發酵的另一重要因素，也是評價麥汁質量的指標之一。最近有研究發現，10種氨基酸的同化量都與酵母發酵性能呈正相關，添加氨基酸可以提高HSP12的表達和海藻糖含量，增強酵母抗逆性[8]。有研究利用大孔樹脂分離小麥面筋水解物，發現分離的組分能顯著提高酵母細胞在不同環境脅迫下的發芽率并保持其形態，增強了酵母的乙醇耐受性、滲透脅迫耐受性[9]。FAN的充足保證了酵母的高效生長以及發酵的順利進行，高濃釀造時則需要更多的游離氨基氮緩解酵母的環境壓力。在高濃釀造中，添加氨基酸明顯促進了酵母生長，提高了活酵母數以及發酵度[10-11]，并且對風味會產生一些影響，如添加組氨酸、亮氨酸、纈氨酸可以提高啤酒醇酯比[11]。還可以添加氨基氮補充劑（如酵母膏、氨基酸）或利用蛋白水解酶提高麥汁氨基氮含量，以改善酵母的發酵性能、增強抗逆性[4]。

綜合以上兩點，在高濃釀造中，酵母的生長需求更加嚴苛，麥汁質量的控制對發酵過程非常重要。應當選擇合適的原料并適當調整麥汁組分以維持酵母的正常繁殖、提高酵母發酵性能，以避免發酵緩慢、發酵殘糖過高等問題。

2.2 高濃釀造條件

釀造條件如發酵溫度、接種量、麥汁濃度等會影響酵母的生命活動及各種生化反應，與啤酒質量息息相關。實際生產中，釀造工藝優化是必要的工作，尤其是高濃釀造，鑒于其釀造方式的特殊性，探究各發酵條件對啤酒發酵周期的影響至關重要。

2.1.1 主發酵溫度對發酵周期的影響

主發酵溫度是影響發酵的一個重要因素，提高主發酵溫度，能加快酵母的生長代謝，從而縮短發酵周期。DRAGONE G等[12]研究了酒糟固定化酵母在3種不同溫度（7 ℃、10 ℃和15 ℃）條件下連續高濃釀造中對發酵的影響。研究發現，隨著發酵溫度升高，發酵度、降糖速率、乙醇生產速率和游離氨基氮消耗量均隨之增加。發酵溫度對風味物質的產生也有較明顯的影響，主發酵溫度越高，高級醇及乙酸酯的產量也越高[13]，影響整體風味。WEBERSINKE F等[14]研究發現20 ℃發酵時，啤酒的風味、口感、整體性最好，適當地提高發酵溫度可以改善啤酒品質。

2.1.2 麥汁濃度對發酵周期的影響

麥汁濃度越高，對酵母生理活性影響越大，有研究發現，隨著麥汁濃度升高，酵母生長緩慢，活細胞率及降糖速率變低[15]，在發酵后期，又有一定乙醇積累，對酵母耗糖影響更大，從而使發酵周期延長。萬春艷等[16]選用常濃酵母菌株分別于12°P、16°P、24°P麥汁中發酵，主發酵周期分別為7 d、15 d、28 d，麥汁濃度對主發酵周期的影響十分顯著。

2.1.3 接種量對發酵周期的影響

在酒類釀造中，經常通過提高酵母接種量來加快發酵，該方法也適用于高濃啤酒生產。提高酵母接種量能夠增加發酵液酵母細胞密度，提高糖利用率，縮短發酵周期[17-18]。然而，提高接種量也會影響風味物質的產生，VERBELEN P J等[19]研究發現，加大接種量會顯著提高雙乙酰含量，不利于啤酒的風味。接種量對一些揮發性醇酯的產生也有影響，有研究發現加大接種量會導致異丁醇產量增加，活性戊醇和異戊醇產量降低[17]。目前關于接種量對啤酒風味影響的研究結果之間存在矛盾，但可以肯定的是提高接種量往往會對風味產生負面作用，雖然該方法可以彌補高濃釀造發酵周期長的缺點，但需要兼顧風味質量并結合實際生產選擇合適的接種量。

2.1.4 溶氧量對發酵周期的影響

在啤酒發酵中，麥汁充氧是很關鍵的工作，酵母接種后必須在一定氧濃度下才可以順利繁殖，若供養不足則會導致發酵遲緩，同時會增加染菌風險[20]。氧能夠促進不飽和脂肪酸和甾醇的合成，甾醇是酵母細胞膜的主要成分，影響多個生物學反應，這兩種物質可以緩解高濃釀造帶來的壓力[21]，而且由于麥汁濃度較高，溶氧水平受到限制，所以需要增加供氧量以保證高濃發酵正常進行。JONES H L等[22]研究了高濃釀造的供養策略，發現適當增加供氧有利于酵母生長繁殖，此外與接種后立即供氧相比，在接種12 h后供氧，發酵時間大大縮減。然而，溶氧量過高會對加速啤酒老化，對風味及非生物穩定性產生不利影響[23]，在進入正常發酵后應嚴格控制溶氧量。

在啤酒釀造中，發酵條件對啤酒釀造的影響不是獨立的，發酵進程與風味物質的產生緊密相關，每個條件的改變都會或多或少導致風味的變化，甚至原料、酵母菌株不同時，改變發酵條件所造成的影響也會有很大差異。實際生產中，要綜合考量各方面需求，調整高濃釀造工藝。

3 菌株質量對高濃釀造發酵周期的影響

3.1 高濃釀造對酵母菌株的影響

高濃釀造在發酵前期滲透壓較高，隨著發酵進行，乙醇累積到一定水平會產生毒害作用。在這種高滲高乙醇毒性環境下，一方面酵母的生理性質會發生改變，包括細胞形態、細胞膜、發酵性能等；另一方面，酵母面對這種環境壓力會產生生理響應，如海藻糖、甘油等[24]維持細胞生理穩定的物質含量增加。高濃釀造對酵母產生的影響反過來也影響著啤酒的生產過程，具體內容如表1所示。

表1 高濃釀造對酵母的影響Table 1 Effect of high gravity brewing on yeast

高濃釀造帶來的環境脅迫會直接影響啤酒酵母多方面的生理性質，導致酵母活力明顯降低，造成發酵緩慢、發酵度低等問題。LI X E等[29]通過紫外線誘變選育出了細胞壁加厚的啤酒酵母，提高了胞內海藻糖水平和細胞活性，在高濃釀造中酵母能夠保持較快的發酵速度。由此可見，選育出抗逆性強的酵母可以作為解決高濃釀造發酵周期長這一問題的途徑。

3.2 酵母性能對高濃釀造發酵周期的影響

3.2.1 酵母絮凝性

酵母絮凝作用是指發酵液中成千上萬個酵母細胞聚集形成絮體并快速沉降的現象[30]，絮凝是啤酒酵母的重要特性。酵母的絮凝性會直接影響啤酒質量[31]：①絮凝性太強，酵母會過早沉降，導致發酵遲緩、雙乙酰還原慢、發酵周期延長，還會造成發酵不徹底、殘糖較高，影響啤酒風味；②絮凝性太差，酵母則懸浮于發酵液中，沉降時間長，不利于酒液澄清過濾，導致酵母難以回收，影響下次發酵。

影響酵母絮凝的因素包括遺傳因素、環境因素。酵母絮凝性由多個FLO基因共同調控，不同FLO基因的組合形成了一系列絮凝特性，不同菌株的絮凝表現存在著較大差異[32]，酵母絮凝性的遺傳調控相當復雜。在啤酒發酵過程中，酵母的絮凝能力也受生理環境的影響，如含氧量、溫度、pH、乙醇濃度、可發酵糖、無機離子[32]。在實際生產中，可以通過育種技術選育絮凝性適中的酵母，結合生產需求適當調整工藝，如調整麥汁組成、改善釀造用水質量等[30]。

3.2.2 酵母的α-葡萄糖苷酶及糖通透酶表達能力

麥汁中主要的三種可發酵糖依次是麥芽糖、麥芽三糖和葡萄糖。葡萄糖通過促進擴散進入酵母細胞參與代謝，麥芽糖和麥芽三糖需借助糖通透酶進入細胞，再經α-葡萄糖苷酶水解，以葡萄糖的形式被利用[33]。葡萄糖會抑制α-葡萄糖苷酶和麥芽糖通透酶的合成，還會降解先前存在的麥芽糖通透酶[34]，因此酵母會在葡萄糖之后利用麥芽糖及麥芽三糖，這兩種糖的發酵是主要限速步驟。啤酒生產中經常存在麥芽三糖消耗延遲甚至殘留的現象，導致發酵不徹底、乙醇產量低。

已知的有關麥芽糖發酵的基因包括MAL、AGT1、MPH、MTT1、MTY1。MAL基因家族是5個端粒相關的MAL基因座，每個基因座至少包含三個基因：MALx1基因編碼麥芽糖通透酶、MALx2編碼α-葡萄糖苷酶和MALx3編碼轉錄調控蛋白，在麥芽糖存在的情況下誘導前兩個基因的轉錄[35]。麥芽糖轉運基因以不同的組合方式存在于不同菌株中，在Lager酵母中主要是MALx1編碼麥芽糖轉運蛋白，Ale酵母中主要是AGT1編碼麥芽糖轉運蛋白，而MPH基因存在于Lager酵母中并且基因表達量較低[36]。HATANAKA H等[37]研究發現，Mal21p對葡萄糖的降解抗性較強，表達該蛋白的菌株有望同時利用葡萄糖和麥芽糖以加速發酵，但研究發現麥芽糖會抑制蛋白質合成，菌株無法生長。若酵母在攝取麥芽糖之前能夠表達足夠麥芽糖酶，就可以避免這種生長缺陷，這也為高濃釀造酵母選育提供了一個方向。

MAL編碼的麥芽糖通透酶一般可以轉運麥芽糖但不能轉運麥芽三糖，而其他幾種都被報道可以轉運麥芽三糖[37-39]，但具體的轉運能力存在諸多爭議。Agt1p可以轉運麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽糖、海藻糖等多種α-葡萄糖苷[37]，并且是麥芽三糖轉運中最主要、研究最多的轉運蛋白。ALVES S L等[40]認為Agt1p可以幫助釀酒酵母高效發酵麥芽三糖，而且麥芽三糖可能是Agt1p更好的誘導劑。不斷有研究發現新型的AGT1基因，如SbAGT1、Seub AGT1[41-42]，可以編碼麥芽三糖轉運蛋白，這些新基因可以用于菌種的選育工作。

酵母的麥芽糖、麥芽三糖轉運機理非常復雜，仍有很大的研究空間，在高濃釀造育種中，這方面相關工作存在較大空白，以α-葡萄糖苷酶及糖通透酶為切入點進行菌種培育可以作為一個新思路。

3.2.3 酵母的雙乙酰合成及還原能力

雙乙酰是發酵過程的副產物，也是啤酒成熟的重要標志，其風味閾值是0.1 mg/L，含量過高會產生餿飯味，嚴重影響啤酒風味。雙乙酰的產生有四條途徑[43]：①酵母合成α-乙酰乳酸釋放到胞外，經過氧化脫羧反應產生；②糖代謝時乙酰輔酶A與活性乙醛反應產生；③污染雜菌有可能產生雙乙酰；④發酵后期酵母自溶釋放α-乙酰乳酸反應生成。啤酒后發酵期主要任務之一是還原雙乙酰，一般來說這個過程比較漫長，因此酵母合成和還原雙乙酰的能力會顯著影響發酵周期。

控制雙乙酰含量的方法主要有三方面，減少α-乙酰乳酸形成；加快α-乙酰乳酸的消耗；加速雙乙酰還原[43]。在工業生產中，可以利用誘變育種、原生質體融合育種、基因工程等手段獲得低產雙乙酰菌株。有研究構建了ILV2等位基因（α-乙酰乳酸合成反應相關基因）缺失、過表達BDH2基因（編碼雙乙酰還原酶）及ILV5基因（編碼乙酰羥酸還原異構酶）菌株進行啤酒發酵實驗，顯著降低了雙乙酰含量[44]。提高酵母的雙乙酰還原力也是生產中常用的方法，不同酵母的雙乙酰還原力有很大差異。BAMFORTH C W等[45]研究發現，乙醇脫氫酶在雙乙酰的還原中有重要作用，除了乙醇脫氫酶，Ale酵母中還發現了一種雙乙酰還原酶，Lager酵母中發現了兩種，雙乙酰還原酶體系更復雜。可以通過定向馴化的方法篩選雙乙酰還原能力強的酵母，有研究已成功利用高濃度雙乙酰或苯磺隆、甲磺隆馴化出雙乙酰降解快的酵母[46]。除了選育優良酵母菌株，還可以利用α-乙酰乳酸脫羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）減少雙乙酰的生成，ALDC可直接將α-乙酰乳酸轉化為乙酰丙酮，在啤酒釀造中利用ALDC可以在不破壞啤酒風味的前提下，縮短后酵時間[47]。

酵母是啤酒的靈魂，優良菌株是優質啤酒生產的前提條件，以上所述只是酵母與發酵周期相關的主要三個性能。OOMURO M等[48]的研究還發現S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）在低溫高濃釀造中起積極作用，在高濃麥汁中，產SAM酵母突變株發酵速率很快。有關高濃釀造酵母的相關研究還需要繼續深入探索，為選育專用酵母提供篩選方向。

4 展望

在高濃釀造啤酒的生產中，發酵緩慢、發酵度低是常見的問題，發酵周期關系著企業的生產效率及經濟效益，因此探究影響高濃釀造發酵周期的因素對實際生產至關重要。綜上所述，高濃釀造技術的特殊性是導致發酵周期長的根本原因，一方面高濃麥汁發酵導致一些工藝條件對發酵周期的影響更顯著；另一方面高濃釀造前期的高滲環境及后期的乙醇毒性對酵母發酵性能造成負面影響，進而使發酵周期延長。因此，為解決發酵周期長這一問題，需要從釀造工藝、酵母選育兩個角度出發。可以通過改善麥汁質量、添加外源物等方法適當調整工藝，酵母選育工作以加速麥芽糖及麥芽三糖發酵為主要思路展開，同時要顧及風味物質生產、啤酒穩定性等方面的需求，以保證啤酒品質。