西藏牦牛糞和乳源中益生菌的篩選與鑒定

王帥靜，李 嘯，2 *，劉玲彥，談亞麗，肖澤濤，王慶宇，裴宇鵬，馮雪娜

（1.三峽大學生物制藥學院 中國輕工業酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司 湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003；3.安琪生物集團有限公司 湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

益生菌即食用者通過攝取適當的量，并對其身體健康有益處的微生物統稱[1-2]。乳酸菌作為一種優良益生菌，具有改善宿主的腸道環境、抑制有害菌的生長[3-4]、提高免疫力[5]、調節腸道黏膜屏障[6]、降低膽固醇含量[7]等優點，有益于宿主身體健康[8]。同時，益生菌憑借其安全、可靠及性能優良等特點在疾病的預防、治療和重癥修復過程中起著重要作用[9-11]。由于益生菌具有良好的降膽固醇，抑制有害菌生長和重癥修復等特性，所以國內外市場對益生菌的需求量每年都在穩步增長[12]。

西藏地區具有低氧、高海拔及晝夜溫差大等特點，有利于篩出抗逆性能較好的工業菌株。咸天成等[13]以保水率、酸化能力和乳清析出率等指標，從西藏藏靈菇中篩選出改善牦牛奶營養價值的桿菌Q5；杜琨[14]采用牛津杯法于西藏高原酸奶中篩選出能夠抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的乳酸菌。目前已有從發酵食品及腸道中篩選出優良益生菌菌株并成功應用于工業生產[15-16]，但是我國益生菌市場上抗逆性能較好的核心工業化菌株相對較少。因此，從西藏地區篩選功能性益生菌并對其抗逆性進行研究具有重要意義。

本研究采用鈣透明圈法從西藏地區牧民家奶酪、牦牛奶、奶牛糞等樣品中分離、篩選益生菌株，采用形態觀察及分子生物學技術進行鑒定，并對所篩選出的益生菌的生長特性、產酸能力、膽鹽、酸、人工胃液耐受性能及抑制大腸桿菌（Escherichia coli）能力進行分析，以期得到耐性比較好、具有工業化潛力的益生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

公牛糞、母牛糞、犏牛糞、奶牛糞、牛犢糞、牦牛奶、犏牛奶、牧民家奶酪：西藏地區。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）標準菌株ATCC25922、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）GL、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）PL、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）SLT：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

細菌通用引物27F、1492R：武漢奧科鼎盛生物科技有限公司；2×T5 Super聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Mix：北京擎科生物科技有限公司；牛膽鹽（生化試劑）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、巰基乙酸鈉（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS固體培養基、MRS肉湯培養基（自然pH 6.2）：北京陸橋技術股份有限公司；膽鹽乳糖（bile lactose，BL）固體培養基：北京索萊寶科技有限公司；SL固體培養基：山東拓普生物工程有限公司。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，121 ℃高壓蒸汽壓滅菌20 min。固體培養基中添加20 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

GDS-8000凝膠成像儀：美國UVP Biolmaging System公司；FP-1100-C Bioscreen全自動生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen有限公司；5418G型離心機：德國Eppendorf公司；XSP-2C顯微鏡：上海長方光學儀器有限公司；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；SP-754紫外可見光分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株種子液制備

乳酸菌種子液培養：挑取保藏于MRS斜面上的乳酸菌單菌落接種于MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養24 h。

大腸桿菌標準菌株ATCC25922種子液的培養：挑取保藏于LB斜面上的大腸桿菌單菌落接種于LB培養基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養24 h。

1.3.2 乳酸菌的分離純化與篩選

分別取1 g樣品于10 mL無菌水中混勻，按10倍梯度依次稀釋至10-7，取稀釋度分別為10-5、10-6、10-7的菌懸液涂布于含0.2%碳酸鈣的MRS、BL和SL固體培養基中[17-18]，于37 ℃條件下靜置培養24～48 h。培養結束后以平板上菌落直徑與透明圈直徑比為指標對產酸菌株進行初步篩選；采用平板劃線法對篩選所得的菌株進行多次純化，以菌落生長情況（表面乳白色）及細胞形態（桿狀）為指標，對樣品中的乳酸菌進行復篩。

1.3.3 乳酸菌菌株的鑒定

形態觀察：將分離菌株接種到MRS固體培養基平板上，37 ℃培養48 h，觀察菌落形態與顯微形態[19]。

分子生物學鑒定：采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[19-20]提取細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[21]為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系：mix 25 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）20 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測合格后，送至奧科鼎盛有限公司測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對搜索[22-23]，若與已知的菌株同源性達97.5%，則認為是同一種[23]。

1.3.4 乳酸菌的生長及代謝特性研究

（1）生長曲線的測定

將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量分別接種至裝有MRS肉湯培養基的微孔板（100孔）中，將微孔板置于全自動生長曲線分析儀中，于37 ℃培養，直到乳酸菌生長至穩定期為止，期間每隔2 h測定OD600nm值，對不同菌株的生長曲線進行繪制。

（2）產酸能力測定[24]

將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量分別接種至MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養24～48 h，培養過程中，每隔3 h取適量發酵液于10 000 r/min離心5 min，取上清液測pH值和乳酸含量。

（3）耐受性分析

膽鹽耐受性：將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量分別接種至含不同膽鹽（0、0.2%、0.4%、0.6%）[18]的MRS肉湯培養基中，置于微孔板（100孔）中，將微孔板置于全自動生長曲線分析儀中，于37 ℃培養48 h，期間每隔2 h測定OD600nm值，對菌株在不同濃度膽鹽下的生長情況進行研究。

酸耐受性：將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量接種至含不同pH（2、3、4、自然（6.2））的MRS肉湯培養基的微孔板（100孔）中，將微孔板置于全自動生長曲線分析儀中，于37 ℃培養48 h，期間每隔2 h測定OD600nm值，對菌株在不同pH值下的生長情況進行研究。

人工胃液耐受性：將乳酸菌的種子液按5%（V/V）的接種量接種至MRS肉湯培養基中，于37℃條件下靜置培養24～48 h取發酵液，測定菌株耐人工胃液（0.20%NaCl、0.30%胃蛋白酶，pH 2.5）的能力[18]，采用平板計數法測定活菌數[18]，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：SLAB為培養2 h的活菌數，CFU/mL；SMRS為培養0 h的活菌數，CFU/mL。

（4）抑制大腸桿菌的能力

將乳酸菌的種子液按5%的接種量接種至MRS肉湯培養基中，于37 ℃條件下靜置培養24～48 h，培養結束后，取發酵上清液為試驗組，SLT、MRS培養基和水均為對照組，采用牛津杯法測抑菌圈直徑[25]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌株的分離及篩選

從樣品中共分離純化出76株細菌，通過革蘭氏染色及鈣透明圈法篩選出25株疑似乳酸菌。部分典型菌株的菌落及細胞形態見圖1，25株疑似乳酸菌的菌落及細胞形態描述見表1。

圖1 典型乳酸菌菌株的菌落形態（A）及細胞特征（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell characteristics (B) of typical lactic acid bacteria strains

表1 乳酸菌菌株的菌落形態及細胞特征描述Table 1 Description of colony morphology and cell characteristics of lactic acid bacteria strains

由圖1及表1可知，篩選得到的25株乳酸菌菌株的菌落均呈圓形、有光澤、表面光滑、有光澤、邊緣規則、微凸起、不透明，細胞呈球狀、桿狀、鏈球狀3種形態。

2.2 乳酸菌菌株的鑒定

25株乳酸菌菌株的鑒定結果見表2。

表2 25株菌株的分子生物學鑒定結果Table 2 Molecular biology identification results of 25 strains

由表2可知，25株乳酸菌中7株為益生菌，包括2株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosum）（T1-1和T1-2）；4株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）（T1-5、T1-7、T1-9、T1-d）；1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（B2）；其他17株菌株為非益生菌，分別為3株食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）；7株腸球菌（Enterococcus）；6株鏈球菌（Streptococcus）；1株微小桿菌（Exiguobacterium）。

2.3 乳酸菌菌株的生長曲線

10株乳酸菌菌株的生長曲線見圖2。

由圖2可知，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-7、T1-9、T1-d、B2、SLT的遲滯期為0～2 h，對數生長期為2～12 h，穩定期為12～48 h。當菌株生長至穩定期，鼠李糖乳桿菌T1-1、T1-2比菌株SLT的生物量多；副干酪乳桿菌T1-5、T1-9、T1-d比菌株GL和T1-7的生長速度快；植物乳桿菌B2生長速度明顯快于菌株SLT。這些菌株短時間生長速度快，符合工業化菌株的要求。因此，選擇在生長方面具有一定優勢的菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2、SLT測定產酸能力。

圖2 乳酸菌菌株的生長曲線Fig.2 Growth curves of lactic acid bacteria strains

2.4 乳酸菌菌株產酸能力的測定結果

以商業化菌株SLT為對照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的產乳酸量與發酵上清液的pH值見圖3。

由圖3A可知，當乳酸菌菌株發酵時間為72 h時，菌株T1-1及SLT的產乳酸能力較強，乳酸含量分別為13.58 g/L和13.46 g/L，其次是菌株T1-2、T1-5、T1-9、T1-d。而菌株B2的產乳酸能力最弱（7.14 g/L），但是由圖3B可知，菌株B2的發酵液pH值最低，因此，推測菌株B2產其他有機酸的能力較強。此外，所有菌株的培養過程中，發酵液pH逐步降低（從pH6.0降低至pH4.0左右），并且結合菌株生長曲線可知，這些菌株的生長能力較高，因此，可以初步推測這些菌株的耐酸能力較高，是符合工業化生產的益生菌菌株。

圖3 乳酸菌菌株產乳酸量（A）與發酵上清液的pH值（B）在發酵過程中的變化Fig.3 Changes of lactic acid yield (A) and pH value of fermentation supernatant (B) of lactic acid bacteria strains during fermentation process

2.5 乳酸菌菌株耐受性分析

2.5.1 耐酸能力測定結果

以商業化菌株SLT為對照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的耐酸能力見圖4。

圖4 乳酸菌菌株耐酸能力的測定結果Fig.4 Determination results of acid resistance ability of lactic acid bacteria strains

由圖4可知，當MRS肉湯培養基的初始pH值為2和3時，7株乳酸菌株幾乎不生長；當初始pH值為4和6.2（自然）時，這7株菌株都能生長。其中菌株B2生長能力較好，因此該菌株表現出較好的耐酸能力。

2.5.2 耐膽鹽能力測定結果

以商業化菌株SLT為對照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的耐膽鹽能力見圖5。

耐膽鹽試驗可以模擬益生菌在人體腸道中的生長繁殖情況，在膽鹽濃度越高的情況下，若菌株仍可生長，則說明該益生菌株可以在人體腸道中生存。由圖5可知，菌株SLT在膽鹽濃度為0.2%時生長能力較好；菌株T1-1、T1-9在膽鹽濃度為0.4%時生長能力較好，而菌株T1-2、T1-5、B2在膽鹽濃度為0.6%時生長能力較好，說明菌株T1-2、T1-5、B2耐膽鹽能力好，比較符合工業益生菌的耐膽鹽要求[26]。

圖5 乳酸菌菌株耐膽鹽能力測定結果Fig.5 Determination results of bile salt resistance ability of lactic acid bacteria strains

2.5.3 乳酸菌菌株耐人工胃液能力的測定結果

以商業化菌株SLT為對照，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2耐人工胃液的能力見圖6。

圖6 乳酸菌菌株耐人工胃液能力Fig.6 Artificial gastric juice resistance ability of lactic acid bacteria strains

由圖6可知，植物乳桿菌B2在人工胃液的存活率最高為57.4%，副干酪乳桿菌T1-2在人工胃液的存活率最低為9%。這幾株菌都能在人工胃液中生存，但是菌株B2相對其他菌株而言，存活率較高，比較符合益生菌的要求。

2.6 乳酸菌菌株對大腸桿菌的抑菌效果

以商業化菌株SLT為對照，MRS培養基及水為空白，菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2對大腸桿菌的抑制能力見圖7。

圖7 乳酸菌菌株對大腸桿菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial effect of lactic acid bacteria strains on Escherichia coli

由圖7可知，與對照組相比，處理組中的大腸桿菌指示菌生長被明顯抑制，且抑菌圈明顯，說明菌株T1-1、T1-2、T1-5、T1-9、T1-d、B2的代謝產物對大腸桿菌有明顯的抑制作用。其中菌株T1-2和B2具有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為22.0 mm和19.5 mm。

3 結論

采用鈣透明圈法從西藏地區不同來源樣品中分離、篩選得到25株乳酸菌，經形態觀察及分子生物學鑒定，確定7株為益生菌，分別為1株植物乳桿菌（Lactobacillus plan tarum），2株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）；4株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseium）。其中植物乳桿菌B2具有良好的生長優勢、產酸能力（發酵終pH值在4左右）、耐酸（pH為4）、耐膽鹽（0.6%）、耐人工胃液能力（菌株存活率為57.4%）以及抑菌效果（抑菌圈直徑為19.5 mm）。本研究可為從西藏地區篩選出益生功能菌株提供一定的指導意義。