高通量測序技術分析茅臺釀酒高粱根際細菌群落特征

劉 婷，肖仲久，李小霞 *，王雙雙

（1.遵義師范學院 生物與農業科技學院，貴州 遵義 563006；2.遵義師范學院 資源與環境學院，貴州 遵義 563006）

高粱（Sorghum bicolorL.）是禾本科、高粱屬植物，是我國白酒釀造的主要原料[1]，紅纓子高粱是國酒茅臺釀造用的唯一有機高粱品種，具有淀粉含量高、纖維層粗厚、耐蒸煮等特性，非常適用于茅臺酒的釀造[2]。然而，紅纓子是茅臺鎮特產的一種有機糯高粱，異地生長的紅纓子其品質和特性與茅臺鎮相比有一定差距。土壤是植物賴以生存的根本，健康的土壤是保證糧食安全的關鍵[3]，土壤健康一般通過物理、化學和生物學指標來衡量[4]，其中微生物的組成、結構、功能就是一項非常重要的指標[5-6]。土壤中存在著地球上種類最為豐富的細菌、古菌、真菌、病毒等微生物群落[7]，土壤微生物的存在影響土壤有機質的合成以及營養物質的轉化，直接影響植物的生長[8-9]。

土壤微生物與植物有著協同進化的關系，一方面植物為微生物提供生長所需營養物質，另一方面土壤微生物將有機物轉化為無機物供植物生長吸收[10]。同時，根際土壤微生物可作為抵御病原菌侵入植物根系的第一道防線[11]，提升土傳病害的根際免疫[12-13]。土壤細菌占土壤微生物的70%～90%，是土壤中分布最廣、含量最多，豐富度最高的一類，能夠有效促進有機質的分解及營養元素的釋放[14]。根際是植物-土壤-微生物相互作用的中心[15]，根際微生物具有分解植物根際有機質、固定氮元素、進行養分轉化等功能，在植物生長發育過程中發揮著極為重要的作用[16]。因此，推測茅臺鎮特產的有機高粱紅纓子，其特有的品質離不開其根際細菌的分布和組成。目前，針對釀酒高粱根際微生態特征的研究相對較少，且研究技術不夠先進，深度不夠，特別是針對茅臺鎮優質釀酒高粱根際細菌群落特征的研究幾乎空白。

高通量測序技術是對傳統測序的一次革命性改變，能夠一次對幾十萬到幾百萬條脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子進行序列測定，具有自動化、通量高、成本低等特點，該技術的出現加速了微生物生態學的發展，它能在整體水平上破譯原位復雜環境中土壤微生物群落多樣性[10，17]。因此，本研究旨在通過高通量測序技術分析茅臺鎮及其周邊地區所種植的紅纓子高粱根際細菌群落特征，這樣能夠全面獲得高粱根際微生物類群信息，分析茅臺鎮特有的微生物特征，對深入分析優質高粱的生長環境，從而擴大其生產面積有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅纓子高粱根際土壤：采集于貴州省茅臺鎮、壇廠鎮、鴨溪鎮大面積種植的高粱根際土；E.Z.N.A.Soil DNA Kit（D5625-01）：美國OMEGA公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Q10212）：美國Life公司；TaqDNA Polymerase（Ep0406）：美國Thermo公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8192）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統：美國UVP公司；T100TM Thermal Cyeler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

本研究選取的三個樣地分別位于貴州省茅臺鎮、壇廠鎮、鴨溪鎮，茅臺鎮是國酒茅臺的原產地，位于仁懷市西13 km，海拔575 m，北緯27°51'13.03"，東經106°23'3.76"；壇廠鎮位于仁懷市南部，距茅臺鎮大約12 km，海拔772 m，北緯27°46'23.10"，東經106°21'55.52"；鴨溪鎮位于遵義市播州區西部，距茅臺鎮70 km，海拔772 m，北緯27°35'17.12"，東經106°41'41.82"。采樣時間為2017年7月3日。每個樣地設置3塊100×100 m 固定實驗樣地，在每塊實驗樣地中設置5×5 m樣方3個，每個樣方內隨機選取5株高粱，除去高粱根部2 cm表層土，取2～20 cm深的土壤剖面，剪取帶有細根的根系，輕輕抖落附在根上的土壤，將剩下的土壤用小刷子刷至無菌自封袋中，貼好標簽置于冰盒中帶回實驗室，保存于-80 ℃箱中用于土壤微生物高通量測序。

1.3.2 土壤微生物的高通量測序

土壤微生物總DNA采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit提取，以其為模板PCR擴增細菌16S rRNA V3-V4區基因序列，所用引物為V3-V4通用引物341F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'），引物添加特異Barcode序列標記用于區分不同樣品。PCR擴增體系：10×PCR buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 10 ng，正、反向引物（50 μmol/L）各0.5 μL，聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，補充雙蒸水（ddH2O）至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3.3 數據分析

通過barcode區分樣品序列，并對各樣本序列進行質量控制（quality control，QC），去除非靶區域序列及嵌合體。基于操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，首先將多條序列根據其序列之間的距離進行聚類，后根據序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU）。利用Mothur軟件以及R語言程序包“VennDiagram”分析并繪制韋恩（Venn）圖分析統計樣本中共有和獨有的OTU的數目，直觀的展現出環境中樣品之間的異同。對處理后序列進行物種分類分析，采用RDP classifier軟件，基于伯杰氏細菌分類方法將序列進行域（domain）、門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）水平物種分類，對每個樣本和每個物種單元分類進行序列豐度計算構建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣，利用SPSS 22.0對不同樣地間同一菌群的相對豐度進行方差分析。通過加權Unifrac計算進化樹中不同環境樣本間Unique branch長度總和，來衡量樣本間物種組成的相似度，利用R語言程序包“pheatmap”繪制樣本距離熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同樣地間高粱根際共有和獨有的OTU的數目

通過分析樣本中共有和獨有的OTU數目繪制Venn圖，結果見圖1。由圖1可知，高粱根際共發現了17 687個細菌OTU，不同樣地之間表現為茅臺鎮（8 241）＞壇廠鎮（7 482）＞鴨溪鎮（7 457）；三個樣地共有OTU為1 352個；茅臺鎮和壇廠鎮共有OTU為2 510個；茅臺鎮和鴨溪鎮共有OTU為2 340個，壇廠鎮和鴨溪鎮共有OTU為1 995個。結果可以看出不同樣地高粱根際細菌物種數量有明顯差別，茅臺鎮細菌OTU數量最多，且獨有的OTU最多，說明茅臺鎮高粱根際細菌物種數最多，且特有細菌種類最多；茅臺鎮與壇廠鎮、茅臺鎮與鴨溪鎮所共有的OTU較壇廠鎮與鴨溪鎮多，說明茅臺鎮高粱根際細菌種類在其他樣地分布較多。有研究發現，土壤微生物多樣性越高，其生態功能、抗環境脅迫和作物生產能力都明顯增高[18]，可以推測茅臺鎮高粱根際土壤相較其他樣地更健康，更利于植物的生長。

圖1 不同樣地共有和獨有的細菌OTU數量Fig.1 Numbers of mutual and unique bacterial OTU among different sample plots

2.2 不同樣地高粱根際細菌群落結構分析

為解析不同樣地高粱根際細菌群落結構特征，對聚類后的OTU代表序列進行物種注釋。三個樣地高粱根際細菌OUT隸屬于25門、55綱、118目、214科、674屬。將相對豐度＜1%的細菌歸于other。基于OTU聚類的結果繪制門水平下細菌菌群分布條形圖，結果見圖2。由圖2可知，在門水平上，三個樣地高粱根際細菌群落組成相似，但相對豐度在不同樣地間存在較大差異。變形菌門（Proteobacteria）細菌在三個樣地高粱根際分布最多，且不同樣地間相對豐度差異并不顯著，擬桿菌門（Bacteroidetes）細菌在三個樣地間分布較多，也未表現出顯著差異，說明變形菌門和擬桿菌門細菌在高粱根際土壤中的生態幅較寬，可能在生態環境構建和物質循環過程中起重要作用。綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）細菌在三個樣地間也有較高的分布，且差異顯著（P＜0.05）。其中茅臺鎮綠彎菌門的相對豐度最高為16.19%，壇廠鎮和鴨溪鎮較低僅為8.01%和3.84%；壇廠鎮的浮霉菌門相對豐度最高為10.84%，茅臺鎮和鴨溪鎮分別為8.96%和8.02%。綠彎菌門在生物圈分布較廣，參與了碳（C）、氮（N）、硫（S）等元素的生物地球化學循環，可以吸收同化環境中生物和非生物來源的多種有機酸物質，用于解決日益嚴重的環境污染問題[19]。茅臺鎮和壇廠鎮釀酒高粱根際細菌中的硝化螺旋菌門（Nitrospirae）細菌相對豐度顯著高于鴨溪鎮（P＜0.05）。研究發現，硝化螺旋菌門對處理高強度有機廢水具有關鍵作用[20]。從結果可以看出，茅臺鎮高粱根際能夠分解污染有機物的細菌分布較廣，這在很大程度上能夠減少污染物對高粱生長的影響，提高高粱的品質。

圖2 基于門水平不同樣地釀酒高粱根際細菌群落結構Fig.2 Bacterial community structure of liquor-making sorghum rhizosphere in different plots based on phylum level

基于OTU聚類的結果繪制屬水平下細菌菌群分布條形圖，結果見圖3。

圖3 基于屬水平不同樣地釀酒高粱根際細菌群落結構Fig.3 Bacterial community structure of liquor-making sorghum rhizosphere in different plots based on genus level

由圖3可知，在屬水平上，未能分類的厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）細菌在茅臺鎮和壇廠鎮分布最多，未能分類的噬幾丁質菌科（Chitinophagaceae）細菌在鴨溪鎮分布最廣。未能分類的厭氧繩菌科細菌在茅臺鎮占比最高達14.2%，顯著高于壇廠鎮和鴨溪鎮（P＜0.05）。研究證明厭氧繩菌是沙漠演變為綠洲過程中出現的重要性指示生物[21]，多適合生活在高水砂、高氨、相對低鹽、高pH值的環境中[22]。可以看出，茅臺鎮高粱品質與其長期生長環境土壤理化性質有明顯的關系，且與厭氧繩菌的生長環境相關。未能分類的噬幾丁質菌科、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）細菌在三個樣地間差異不顯著；壇廠鎮和鴨溪鎮的固氮螺菌屬（Azospira）細菌相對豐度顯著高于茅臺鎮（P＜0.05），茅臺鎮和壇廠鎮的未能分類的浮霉菌科（Planctomycetaceae）細菌相對豐度顯著高于鴨溪鎮（P＜0.05）。浮霉菌是目前發現的具有厭氧氨氧化功能的細菌來源[23]，在過量施用氮肥的農田土壤生態系統氮移除[24-26]方面有重要作用，屬于生態友好型微生物，對全球氮循環具有重要意義。可以推測此類細菌可以改善茅臺鎮高粱根際土壤過量施氮肥情況，從而保證高粱品質。

采用樣本間加權Unifrac距離矩陣繪制距離熱圖，結果見圖4。由圖4可知，茅臺鎮和壇廠鎮高粱根際細菌組成和分布相似度最高，其次為壇廠鎮和鴨溪鎮，茅臺鎮和鴨溪鎮的距離最遠。說明距離對高粱根際細菌組成和分布有一定的影響，距離越近其相似度越高。

圖4 不同樣地釀酒高粱根際間細菌群落相似度距離熱圖Fig.4 Distance heap map of bacterial community similarity of liquor-making sorghum rhizosphere among different plots

3 結論

茅臺鎮高粱根際細菌物種數、特有細菌種類最多，且茅臺鎮高粱根際細菌種類在其他樣地分布較多。三個樣地細菌群落組成相似，但相對豐度存在較大差異。在門水平上，變形菌門細菌在三個樣地分布最多，且相對豐度差異不顯著。綠彎菌門、浮霉菌門在三個樣地間有較高的分布，不同樣地間差異顯著，且綠彎菌門在茅臺鎮的相對豐度最高。在屬水平上，茅臺鎮未能分類的厭氧繩菌科細菌豐富度顯著高于壇廠鎮和鴨溪鎮。聚類分析結果顯示茅臺鎮和壇廠鎮的細菌分布和組成相似度最高。