高產苯乳酸菌株的篩選及其在豆粕發酵中的應用

謝全喜，侯楠楠，王 梅，王 倩，曹 斌，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態制劑重點實驗室，山東 泰安 271000）

苯乳酸即3-苯基乳酸或β-苯乳酸，是近年來發現的一種新型有機酸，具有廣譜的抑菌活性，對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌均有抑菌作用[1]。目前制備苯乳酸的方法主要有化學合成法和微生物發酵法，其中微生物發酵法因反應條件溫和、安全環保等優點成為理想的制備方法[2]。苯乳酸產生菌的篩選研究表明，大部分乳酸菌都能產生苯乳酸[2-3]，此外還有白地霉[4]、丙酸菌[5]、片球菌[6]和芽孢桿菌[7]等菌株。其中乳酸菌作為重要的益生菌，應用歷史悠久、安全性高，且農業部頒布的飼料添加劑品種目錄中明確規定植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等乳酸菌可以添加進飼料中應用于動物生產。有研究表明，應用干酪乳桿菌和植物乳桿菌[8-9]等乳酸菌菌株發酵，苯乳酸產量多在2.0 g/L以下，無法滿足規模化生產要求，因此，篩選苯乳酸高產菌株尤為重要。目前苯乳酸生物合成研究中利用的底物有苯丙氨酸和苯丙酮酸，苯丙酮酸是苯乳酸合成的最直接前體[1]，苯丙氨酸主要被氨基轉移酶轉化成苯丙酮酸后，再被還原為DL-苯乳酸，苯丙氨酸的轉氨反應是苯乳酸合成的限速步驟，用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作為底物可有效突破這一瓶頸。王立梅等[10]研究發現，在乳酸菌發酵過程中外源添加苯丙酮酸可以顯著提高苯乳酸產量。

微生物保鮮技術具有天然、無毒、無抗生素抗性、保鮮效果好等優點[11]。乳酸菌作為一種新型生物保護劑，可以產生拮抗代謝產物（如苯乳酸和乳酸鏈球菌素等）控制腐敗菌滋生[12]，且由于苯乳酸抑菌譜廣泛、安全穩定，被廣泛應用在食品生產、醫藥、化妝品工業和飼料等行業中，研究發現苯乳酸可作為一種飼料添加劑代替抗生素直接應用到飼料行業中，具有改善機體生產性能、提高其能量消化率及免疫力[13]等功效。但并未發現其作為防腐劑應用在豆粕發酵中。豆粕是制作牲畜與家禽飼料的主要原料，豆粕發酵后可顯著降低或鈍化其中的抗營養因子，將大分子蛋白質分解為小肽或氨基酸，顯著提高粗蛋白、酸溶蛋白和總酸含量，提高其消化率[14]。豆粕一般是生料直接發酵，微生物在豆粕發酵過程中的活動及代謝產物會影響豆粕的發酵品質，其中不良微生物如大腸桿菌（Escherichia coli）和霉菌等大量繁殖會消耗豆粕的營養物質，從而降低發酵品質。將高產苯乳酸的乳酸菌應用在豆粕發酵中，乳酸菌發酵可以改善豆粕品質，同時產生苯乳酸可以抑制不良微生物的生長，減少營養損失。因此，篩選高產苯乳酸的菌株應用在豆粕發酵中就顯得尤為重要。

本研究旨在以實驗室保存的性能優良的乳酸菌為出發菌株，利用薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法篩選高產苯乳酸的乳酸菌，并利用該菌株對豆粕進行固體發酵，研究其對發酵豆粕中微生物、酸溶蛋白、總酸和苯乳酸含量等的影響，以期達到提高發酵豆粕中苯乳酸含量，延長發酵飼料保質期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料及菌株

去皮豆粕：市售，黃色、無霉變、無結塊和異味，粉碎后過篩。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0410、BLCC2-0126、BLCC2-0111、BLCC2-0092、BLCC2-0069、BLCC2-0001、BLCC2-0015；發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）BLCC2-0021、BLCC2-0063、BLCC2-0296：由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物工程研究院菌種資源保藏中心保存。

1.1.2 培養基

MRS培養基[15]：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母膏4 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.3 g、檸檬酸銨2 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，調pH值至6.0，121 ℃滅菌20 min。固體培養基中添加瓊脂20 g。

1.1.3 試劑

葡萄糖（生化試劑）：山東祥瑞藥業有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏、牛肉膏（均為生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：濟南匯豐達化工有限公司；檸檬酸銨（分析純）：上海撫生實業有限公司；乙酸鈉（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80：天津凱通化學試劑有限公司；三氟乙酸、甲醇（均為色譜純）：天津市永大化學試劑有限公司；微孔濾膜（直徑13 mm、孔徑0.22 μm）：上海安譜有限公司；苯丙酮酸標準品、DL-3苯乳酸標準品（純度均＞99%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C雷磁精密pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DHP-9082數顯恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：常州諾基儀器有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP308消化爐：上海纖檢儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；SHB-ⅢS循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海弛唐電子有限公司；SD120D超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SX2-4-10箱式電阻爐：龍口市電爐制造廠；LD5-2A低速離心機：北京京立離心機有限公司；SW-CJ-2F（2）超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LC-20A HPLC儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 產苯乳酸菌株的篩選

將被試乳酸菌菌株接種于MRS固體斜面培養基上，37 ℃靜置培養24 h。將培養好的斜面在無菌條件下用接種環接種2環于100 mL含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養基中，在37 ℃條件下靜置培養24 h，4 000 r/min離心10 min，棄菌體，取發酵上清液采用薄層層析法[16]檢測被試菌株發酵液中是否有苯乳酸產生。

1.3.2 高產苯乳酸菌株的篩選

將薄層層析法篩選得到的可能產生苯乳酸的乳酸菌菌株接種于MRS固體斜面培養基上，37 ℃靜置培養24 h。將培養好的斜面在無菌條件下用接種環接種2環于100 mL額外添加3.0 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養基中，在37 ℃條件下靜置培養24 h和48 h，4 000 r/min離心10 min，棄菌體，取發酵上清液采用高效液相色譜法檢測被試菌株發酵液中苯乳酸含量[17]。

1.3.3 發酵底物的選擇

將乳酸菌菌株BLCC2-0069接種于MRS固體斜面培養基上，37 ℃靜置培養24 h。將培養好的斜面在無菌條件下用接種環接種2環于100 mL額外添加3.0 g/L苯丙酮酸或苯丙氨酸的MRS液體培養基中，在37 ℃條件下靜置培養24 h和48 h，4 000 r/min離心10 min，棄菌體，取發酵上清液采用高效液相色譜法檢測被試菌株發酵液中苯乳酸含量，以期篩選最優發酵底物。

1.3.4 產苯乳酸菌株對豆粕發酵品質的影響

發酵種子液的制備：將篩選的3株產苯乳酸菌株接種于MRS固體斜面培養基上，37 ℃培養24 h；將培養好的斜面，在無菌條件下用接種環挑取一環接種至15 mL MRS培養基中，于37 ℃靜置培養24 h；按照2%（V/V）的接種量接種至250 mL MRS液體培養基中，于37 ℃靜置培養24 h。

準確稱取一定量的國產去皮豆粕，按照去皮豆粕的0.15%加入苯丙酮酸，料水比為1.00∶0.45（g∶mL），裝料量200 g/袋，壓實。按2%接種量分別接入培養好的乳酸菌種子液，以不接種任何菌株的豆粕為對照組，每組設3個平行，均置于37 ℃培養箱進行厭氧固態發酵，分別于發酵72 h取樣，測定發酵料中微生物、總酸、粗蛋白、酸溶蛋白和苯乳酸含量，以期篩選高產苯乳酸菌株。

1.3.5 高產苯乳酸菌株發酵時間對豆粕發酵品質的影響

按照1.3.4方法采用高產苯乳酸菌株固態發酵豆粕，分別于發酵1 d、2 d、3 d、5 d和7 d取樣，測定發酵料pH值、乳酸菌、總酸含量和苯乳酸含量。以只添加菌株的豆粕為對照組；以既不添加苯丙酮酸也不接種任何菌株的豆粕為空白組。

1.3.6 分析檢測方法

（1）理化指標

pH值采用pH計測定；水分含量：按GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》測定；粗蛋白含量（以干物質計）：按GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》測定；酸溶蛋白含量（以干物質計）：按GB/T 22492—2008《大豆肽粉》酸溶蛋白測定；總酸含量（以乳酸計）：參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》測定。

（2）微生物指標

分別按照國標GB/T 4789.35—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》、GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》及GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》。

1.3.7 數據分析

試驗數據采用Excel2007進行初步處理后，采用SPSS13.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析（one-wayANOVA）程序進行方差分析，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 產苯乳酸菌株的篩選

采用TLC法篩選產苯乳酸菌株，結果見表1。

表1 薄層層析法篩選產苯乳酸乳酸菌菌株結果Table 1 Screening results of lactic acid bacteria strains producing phenyllactic acid by thin layer chromatography method

由表1可知，從10株乳酸菌株共檢出3株產苯乳酸的菌株，分別為植物乳桿菌BLCC2-0069、BLCC2-0410和發酵乳桿菌BLCC2-0021。

2.2 高產苯乳酸菌株的篩選

采用HPLC法對3株乳酸菌菌株的苯乳酸產量進行檢測，結果見表2。

表2 3株乳酸菌菌株的苯乳酸產量Table 2 Phenylactic acid yield of three lactic acid bacteria strains

由表2可知，發酵24 h時菌株BLCC2-0069發酵液中苯乳酸含量最高，為1.259 g/L，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）；發酵48 h時菌株BLCC2-0069發酵液中苯乳酸含量最高為1.435g/L，分別高于菌株BLCC2-0021和BLCC2-0410的58.21%和8.79%，差異顯著（P＜0.05）。齊世華等[9]研究發現，植物乳桿菌Lp45發酵液中苯乳酸含量達到98.3 mg/L，在發酵乳中接菌量為150 U/T時抑制霉斑產生的能力強于商業保鮮產品。微生物發酵法已成為一種理想的制備苯乳酸的方法，不同微生物菌種產苯乳酸能力不同，篩選優良的微生物菌種是影響苯乳酸產量的首要條件。LAVERMICOCCA P等[18]從酸面團里分離到的植物乳桿菌能夠產生苯乳酸，產量為56mg/L。隨后研究者發現多種乳酸菌均可產生苯乳酸，楊小院等[19]研究發現，植物乳桿菌發酵生產苯乳酸條件優化后產量為（252.44±2.63）mg/L，與優化前（115.99±4.25）mg/L相比，產量提高了1.17倍；GUIMARAES A等[20]研究發現，Lactobacillus plantarumUM55的發酵上清液可以抑制黃曲霉的生長，并減少黃曲霉毒素的產生，其中一種抑菌物質就是苯乳酸。在本研究中，利用高效液相色譜法篩選到一株高產苯乳酸的植物乳桿菌BLCC2-0069，液體發酵48 h時發酵液中苯乳酸含量為1.435 g/L，高于現有文獻中報道的苯乳酸含量。

2.3 發酵底物的選擇

不同底物對菌株BLCC2-0069發酵產苯乳酸的影響見表3。

表3 不同底物對菌株BLCC2-0069發酵產苯乳酸的影響Table 3 Effect of different substrates on phenyllactic acid production by strain BLCC2-0069

由表3可知，菌株BLCC2-0069發酵24 h時，以苯丙酮酸為底物的發酵液中苯乳酸含量最高，為3.965 g/L，顯著高于對照組和苯丙氨酸組（P＜0.05）。以苯丙氨酸為底物的發酵液中苯乳酸含量次之，為2.099 g/L，顯著高于對照組66.72%（P＜0.05）；隨發酵時間延長發酵液中苯乳酸含量增加，發酵48 h時，以苯丙酮酸為底物的發酵液中苯乳酸含量最高，為4.387 g/L，其次是苯丙氨酸為底物組，但均顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，以3 g/L添加苯丙氨酸或苯丙酮酸均能夠提高發酵液中苯乳酸含量，且以苯丙酮酸效果最好，發酵48 h發酵液中苯乳酸含量高達4.387 g/L。

苯丙氨酸和苯丙酮酸是合成苯乳酸的重要前體，通過外源添加前體，利用微生物轉化前體合成苯乳酸，可以提高苯乳酸產量[21-22]。RODRIGUEZ N等[23]研究發現，以0.6 g/L苯丙氨酸為底物時，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）轉化苯丙氨酸合成（4.25±0.18）mmol/L苯乳酸；WANG L M等[24]在干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）W2發酵過程中間歇流加苯丙酮酸，發酵36 h時，苯乳酸產量達到2.121 g/L，轉化率為47.2%。在本研究中，乳酸菌BLCC2-0069液體發酵時，以3 g/L添加苯丙氨酸或苯丙酮酸均能夠提高發酵液中苯乳酸含量，其中以苯丙酮酸為底物時苯乳酸產量較高，發酵48 h發酵液中苯乳酸含量高達4.387 g/L。

2.4 產苯乳酸菌株對豆粕發酵品質的影響

3株產苯乳酸菌株發酵對豆粕微生物指標的影響見表4，對pH值、總酸、粗蛋白、酸溶蛋白及苯乳酸含量的影響見表5。

表4 乳酸菌發酵對豆粕微生物指標影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria fermentation on microbial indexes of soybean meal

表5 乳酸菌發酵對豆粕理化指標的影響Table 5 Effect of lactic acid bacteria fermentation on physical and chemical indexes of soybean meal

由表4可知，3株乳酸菌發酵72 h后，豆粕中乳酸菌活菌數均＞109CFU/g，顯著高于對照組（P＜0.05）；乳酸菌BLCC2-0021發酵豆粕的霉菌活菌數為0.956×103CFU/g，乳酸菌BLCC2-0069和BLCC2-0410兩菌株發酵豆粕的霉菌活菌數均≤10 CFU/g，均顯著低于對照組（4.352×104CFU/g）（P＜0.05），說明乳酸菌BLCC2-0069和BLCC2-0410發酵豆粕具有較好的抑制霉菌生長的作用。大腸桿菌均未檢出。

由表5可知，3株乳酸菌發酵72 h后，豆粕的pH值均顯著低于對照組（P＜0.05），其中乳酸菌BLCC2-0069發酵時pH值最低，為4.530；3株乳酸菌發酵豆粕對水分含量影響無顯著性差異（P＞0.05）；與對照組相比，3株乳酸菌發酵豆粕72 h后均能夠顯著提高總酸含量、粗蛋白含量和酸溶蛋白含量（P＜0.05），且均以乳酸菌BLCC2-0069發酵豆粕時最高，比對照組分別高140.60%、5.489%和137.669%。粗蛋白含量的升高，可能是乳酸菌利用自身氮源代謝產生新的蛋白質；酸溶蛋白的提高則是由于乳酸菌可以產生蛋白酶，將大分子的蛋白分子成小分子的肽。與對照組相比，乳酸菌BLCC2-0021、BLCC2-0069和BLCC2-0410發酵豆粕72 h后均能顯著提高苯乳酸含量（P＜0.05），分別是對照組的21.90倍、25.52倍和19.77倍，其中以乳酸菌BLCC2-0069發酵時苯乳酸含量最高，為424.019 mg/kg發酵料。結果表明，3株乳酸菌均可以顯著提高發酵豆粕中的苯乳酸含量。

豆粕是目前畜牧養殖中使用量很大的一種優質植物性蛋白源，粗蛋白含量高達43%～48%，富含多種氨基酸。利用乳酸菌發酵豆粕，降低發酵豆粕pH值[14]，使發酵豆粕具有酸香味，同時富含活性益生菌，乳酸、乙酸和檸檬酸等各種有機酸，增加了飼料的營養性和適口性，促進畜禽采食[25]。在乳酸菌繁殖過程中將豆粕中的非蛋白氮轉化成營養價值更高的菌體蛋白，有利于動物的消化吸收，提高豆粕利用率。張佳斌等[26]研究發現，單純乳酸菌發酵豆粕72 h粗蛋白質量分數為48.6%，有酸香味。王梅等[27]研究發現，復合益生菌發酵劑發酵豆粕能夠顯著降低pH值，顯著提高粗蛋白、酸溶蛋白、總酸和乳酸含量（P＜0.05）。

本研究中，植物乳桿菌BLCC2-0069發酵豆粕72 h時pH值為4.530，乳酸菌活菌數＞109CFU/g發酵料，且能夠顯著提高總酸含量、粗蛋白含量和酸溶蛋白（P＜0.05），分別比對照組高140.60%、5.489%和137.669%，苯乳酸含量是對照組的25.523倍，改善了發酵豆粕品質。

2.5 植物乳桿菌BLCC2-0069發酵時間對豆粕發酵品質的影響

高產苯乳酸菌株BLCC2-0069發酵時間對豆粕pH值、乳酸菌活菌數、總酸及苯乳酸含量的影響見表6。

由表6可知，pH值方面，發酵1 d和2 d時均以對照組最低，其次是試驗組，均顯著低于空白組（P＜0.05）。發酵至3 d、5 d和7 d時對照組和試驗組間pH值差異不顯著（P＞0.05），降至4.5左右，均顯著低于空白組（P＜0.05）。

表6 菌株BLCC2-0069發酵對豆粕pH值、乳酸菌、總酸含量和苯乳酸含量的影響Table 6 Effect of strain BLCC2-0069 fermentation on pH value,lactic acid bacteria,total acid content and phenyllactic acid content of soybean meal

乳酸菌活菌數方面，發酵1 d時以對照組最高，乳酸菌活菌數＞109CFU/g，試驗組活菌數次之，低于對照組一個數量級，但均顯著高于空白組（P＜0.05），說明菌株BLCC2-0069能夠較好地發酵豆粕。發酵2 d時活菌數以對照組最高，試驗組活菌數繼續增加，和對照組均＞109CFU/g。發酵3 d時試驗組和對照組活菌數間差異不顯著（P＞0.05），活菌數均達到最高，均＞109CFU/g。之后隨發酵時間延長，活菌數均呈現下降趨勢，但對照組和試驗組間活菌數一致。分析原因可能是試驗組由于苯丙酮酸的添加延緩了乳酸菌的發酵，但在3 d時和對照組達到一樣的水平。乳酸菌活菌數呈現先升高后降低的趨勢，在發酵3 d時活菌數達到最高，這和pH值結果比較一致。發酵5 d后，乳酸菌活菌數出現大量減少，可能是乳酸菌前期生產過程產生氧氣、利用了營養物質，在后期造成環境困擾以及營養缺失，抑制其生長。

總酸含量方面，發酵1 d時以對照組最高，顯著高于其余兩組（P＜0.05），試驗組總酸含量略高于空白組，差異不顯著（P＞0.05）。發酵2 d時對照組和試驗組總酸含量大幅增加，以對照組最高，顯著高于其余兩組（P＜0.05），試驗組總酸含量是發酵1 d時的2.14倍，顯著高于空白組（P＜0.05）。發酵3 d、4 d和5 d時對照組和試驗組總酸含量差異不顯著（P＞0.05），均顯著高于空白組（P＜0.05）。總酸含量在發酵前期1～2 d增長較快，其中試驗組由于苯丙酮酸的添加延緩了發酵速度，發酵至3 d時總酸含量和對照組處于相同水平。

苯乳酸含量方面，隨發酵時間的延長，對照組和試驗組苯乳酸含量一直在增加，直至發酵結束（7 d）時達到最高。雖然乳酸菌的活菌數在降低，但是苯乳酸作為一種化學物質不會降低，但會積累。試驗組由于添加了苯丙酮酸苯乳酸含量一直顯著高于對照組，說明苯丙酮酸的添加有利于苯乳酸的合成，發酵3 d時苯乳酸含量達到429.102 mg/kg發酵料，發酵結束（7 d）時含量為870.903 mg/kg發酵料。

3 結論

利用TLC及HPLC法從10株乳酸菌中篩選到一株高產苯乳酸的植物乳桿菌BLCC2-0069，液體發酵48 h時，苯乳酸含量高達1.435 g/L。其以3 g/L苯丙酮酸為底物發酵48 h時發酵液中苯乳酸含量最高為4.39 g/L。利用該菌株固態發酵豆粕3 d時，乳酸菌活菌數＞109CFU/g，霉菌活菌數≤10 CFU/g，大腸桿菌未檢出；pH值降至4.5左右，水分、粗蛋白、酸溶蛋白、總酸及苯乳酸含含量分別為36.78%、46.65%、10.51%、26.37 g/kg和424.02 mg/kg，發酵效果顯著優于對照組。