丁酸梭菌的生物學特性分析及發酵培養基優化

亓秀曄，張志焱，謝全喜，劉乃芝，郭楊麗，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態制劑省級重點試驗室，山東 泰安 271000）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名宮入菌、酪酸菌、丁酸梭狀芽孢桿菌，屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）梭菌屬（Clostridium），是一種從健康人和動物腸道中分離出的厭氧芽孢桿菌，因其具有產生芽孢的益生功能被廣泛的研究[1]。近年來，丁酸梭菌不斷被分離出來，其益生性能也得到了廣泛認可[2-4]。丁酸梭菌代謝產物在促進腸道有益微生物增殖、抑制其他有害菌及腐敗菌的生長、減少腸道傳染性病害發生、提高機體免疫力等方面起著重要作用[5-7]。尤其是主要產物丁酸是腸道上皮細胞修復和再生的主要物質，能促進畜禽腸道的發育，強化其各種功能，增強畜禽免疫力和抗病力[8]，為結腸黏膜細胞提供主要能量，并為腸道細胞增殖與成熟提供重要保障等[9]。如菌株ZJU-F1[10]、普拉氏梭桿菌（Fusobacterium prauznitzii）[11]、腸道羅斯拜瑞氏菌（Roseburiaintestinalis）[12]、Butyricicoccuspullicaecorum[13]、菌株C1-6[14]等均具有較強的產酸能力。

此外，已有不少學者研究丁酸梭菌生長的發酵培養基，但多數研究發現其優化培養基或者成分復雜、提升效果不大或者需要額外加還原劑等。如李雯靜等[15]分離出1株羊源丁酸梭菌HDRyYB1，經Plackett-Burman（PB）試驗設計法和響應面法優化后，菌株HDRyYB1發酵完全（18 h）的芽胞數為1.478×108CFU/mL，是優化前的2.7倍；夏會麗等[3]采用響應面法對丁酸梭菌HBUT-01的培養基配方進行優化，確定丁酸的比生成速率、細胞得率系數分別比優化前降低了20%和提高了132%，說明優化后酸脅迫效應得到了緩解，細胞活性得到了有效的維持，使得生物量（14 h）達到了9.32×108CFU/mL，是優化前（4.16×108CFU/mL）的2.24倍；胡曉龍等[16]采用單因素試驗結合正交試驗優化酪丁酸梭菌RL1的發酵條件，優化后該菌株的丁酸產量可達10.66 g/L，較優化前提高了41.76%。

丁酸梭菌在生長過程可形成芽孢，在最終商品化的菌劑中，活菌大都以芽孢的形式存在，條件適宜時可再次萌發為菌體，從而產生各種益生代謝產物而發揮作用[17]。本研究從四株丁酸梭菌出發，通過測定菌株產酸性能、產酶活力、抑菌性能和抗逆性等，篩選生物學性能最優的丁酸梭菌（Clostridium butyricum），并以活菌數為響應值，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和響應面試驗對其發酵培養基組成進行優化。旨在提高該菌株的芽孢數量，為商品化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

四株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）（BLCC1-0021、BLCC1-0022、BLCC1-0023和BLCC1-0024）：均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

抑菌試驗所用標準菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）MASA、表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）CMCC（B）26069、宋內志賀氏菌（Shigella sonnei）CMCC（B）51592、雞大腸桿菌（Escherichia coli）O1、豬大腸桿菌C249、產毒素大腸桿菌K88、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）C79-20、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、腸炎沙門氏菌ATCC 13076：購自國家獸醫微生物菌種保藏管理中心，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養基

梭菌增殖培養基[18]：葡萄糖30 g/L，蛋白胨20 g/L，牛肉浸膏15 g/L，CaCO320 g/L，pH 7.0±0.2，118 ℃滅菌30 min。固體培養基中加瓊脂15 g/L。

梭菌計數培養基[18]：胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂基礎培養基，按照說明書配制，需額外添加0.5%的D-環絲氨酸溶液。

淀粉瓊脂平板[19]：可溶性淀粉1 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、瓊脂8 g/L，pH 7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min；

纖維素剛果紅培養基平板[19]：羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na）2 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO41 g/L、剛果紅0.2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂基礎培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖、可溶性淀粉（均為生化試劑）、CaCO3（均為分析純）：山東祥瑞藥業有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉浸膏、酵母浸膏（均為生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；D-環絲氨酸（分析純）：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LABS厭氧培養箱：美國PLAS-LABS；T6新世紀紫外可見分光光度計：上海普元儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 丁酸梭菌發酵液的制備

接種鏟取丁酸梭菌沙土管1/4鏟于裝有100 mL梭菌增殖培養基的100 mL絲口瓶中，擰緊瓶蓋，于37 ℃靜置培養24 h，4 ℃保存待用。

1.3.2 丁酸梭菌菌株生物學特性比較

將上述活化的四株丁酸梭菌發酵液分別按照2%（V/V）接種量接種于梭菌增殖培養基，37 ℃靜置培養24 h。分別測定四株丁酸梭菌的產酸性能及發酵液的活菌數、芽孢率、抑菌性能、淀粉酶活力、纖維素酶活力、模擬胃液和模擬小腸液存活率。

1.3.3 丁酸梭菌BLCC1-0022培養基優化響應面試驗

前期試驗，以活菌數為考察指標，確定最優碳源為可溶性淀粉，最優氮源為蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，最優無機鹽為CaCO3、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O。在此基礎上對其培養基成分的含量進行響應面優化。

（1）Plackett-Burman（PB）試驗

以活菌數（Y）為響應值，選取可溶性淀粉（A）、蛋白胨（B）、牛肉浸膏（C）、酵母浸膏（D）、CaCO3（E）、MgSO4·7H2O（F）、MnSO4·H2O（G）為考察因素。選用N=15的試驗設計，對7個因素同時進行考察，每個獨立變量設置兩個級別，分別為高水平（+1）和低水平（-1）；設置3個中心點（5/13/15）。設計15個梯度，每個梯度2個平行的PB試驗。將上述活化的丁酸梭菌BLCC1-0022發酵液分別按照2%（V/V）的接種量接種于各分組培養基，37 ℃靜置培養24 h，檢測活菌數。應用Design Expert 8.0.6軟件進行PB試驗及對試驗結果進行分析，PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett Burman experimental design

（2）最陡爬坡試驗結果

根據PB試驗結果，確定對丁酸梭菌活菌數具有正效應和負效應的因素，根據線性回歸方程系數，通過增大正效應因素的添加量和減少負效應因素的添加量來提高丁酸梭菌發酵液活菌數。設計10個梯度，每個梯度2個平行的最陡爬坡試驗。

（3）響應面試驗

根據PB試驗和最陡爬坡試驗結果，設計4因素、3水平、5個中心試驗點、29組試驗的Box-Benhnken（BB）響應面試驗。試驗結果用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，得到理論最優點。每個組合2個平行。

1.3.4 測定方法

產酸性能[18]：將各發酵液4 000 r/min離心10 min，采用分光光度法測定發酵上清液中丁酸和乙酸含量。

抑菌性能：用無菌的0.9%的生理鹽水將各發酵液菌體濃度稀釋至1×105～1×106CFU/mL范圍內，采用牛津杯法（內徑6 mm）[11]比較四株菌的抑菌能力，以抑菌圈直徑的大小（mm）表示。試驗時標準菌株菌液濃度均為100 CFU/mL。

活菌數[18]：采用稀釋平板計數法測定發酵菌液中丁酸梭菌活菌數。

芽孢率[12]：先將發酵液按照上述方法進行活菌計數，另取發酵液于80 ℃水浴處理10 min后再用稀釋平板計數法測定芽孢數，重復3次，計算芽孢率，其計算公式如下：

淀粉酶活力[19]：取相同OD600nm值的1 mL各發酵液滴加到淀粉瓊脂平板指定位置，厭氧培養24 h，然后在其表面覆蓋一層碘液（5 mmol/L I2和5 mmol/L KI），觀察并測定透明圈的直徑。

纖維素酶活力[19]：取相同OD600nm值的1 mL各發酵液滴加到纖維素剛果紅培養基平板的指定位置，厭氧培養24 h，測定透明圈的直徑。

模擬胃液存活率和模擬腸液存活率[20]：人工胃液和人工腸液參照《中國藥典》2015版附錄項下進行配制。將培養24 h的丁酸梭菌發酵液分別接種于人工胃液和人工腸液中，37 ℃恒溫厭氧培養3 h，重復3次，測定活菌數，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌生物學特性的比較

2.1.1 產酸性能比較

對4株丁酸梭菌產丁酸及乙酸性能比較，結果見表2。

表2 不同丁酸梭菌菌株產丁酸及乙酸能力比較Table 2 Comparison of butyric acid and acetic acid production capacity of different strains of Clostridium butyricum

由表2可知，發酵24 h時，菌株BLCC1-0022產丁酸的性能顯著高于菌株BLCC1-0021和BLCC1-0024（P＜0.05），高于菌株BLCC1-0023（P＞0.05）；菌株BLCC1-0022產乙酸性能顯著高于其余菌株（P＜0.05）。結果表明，菌株BLCC1-0022的產丁酸和乙酸性能最優。與文獻中相比較，菌株BLCC1-0022產丁酸的性能還遠優于菌株ZJU-F1[10]（1.87 g/L）、Fusobacterium prauznitzii[11]（1.4 g/L）、Roseburia intestinalis[12]（0.8～1.2 g/L）、Butyricicoccus pullicaecorum[13]（1.1 g/L）和菌株C1-6[14]（2.1 g/L）等。

2.1.2 丁酸梭菌發酵液抑菌性能比較

4株丁酸梭菌發酵液對9種指示菌的抑制能力見表3。

表3 不同丁酸梭菌菌株發酵液的抑菌能力比較Table 3 Comparison of bacteriostatic ability of different strains of Clostridium butyricum

由表3可知，4株丁酸梭菌的發酵液對9株指示菌均具有抑菌活性。其中菌株BLCC1-0022的抑菌能力最優。除產毒素大腸桿菌K88及腸炎沙門氏菌ATCC 13076外，菌株BLCC1-0022對目標菌的抑菌性能均高于其他三株菌。這與王倩等[4，21]的研究結果一致，這可能與丁酸梭菌產生的丁酸、抗菌肽等抑菌物質有關[8，10]。

2.1.3 丁酸梭菌產酶性能和模擬胃腸道耐受性能比較

由表4可知，4株菌的活菌數和芽孢率差異不顯著（P＞0.05），芽孢率均＞80%，活菌數最高的為菌株BLCC1-0022；且菌株BLCC1-0022模擬胃液存活率和模擬小腸液存活率較高，都＞95%，優于菌株C1-6[14]，說明菌株BLCC1-0022在腸道內有較高的耐受性，這與丁酸梭菌在生長后期形成的芽孢有關[22]。

表4 不同丁酸梭菌菌株的生物學性能比較Table 4 Comparison of biological properties of different Clostridium butyricum

此外，菌株BLCC1-0022的產淀粉酶和纖維素酶活力均顯著高于其余菌株（P＜0.05），益生菌在腸道內產生的淀粉酶可以將碳水化合物降解為低聚糖，促進益生菌對碳源的利用[23]。綜合來看，丁酸梭菌BLCC1-0022生物學性能最優。

2.2 丁酸梭菌BLCC1-0022培養基組成優化響應面試驗

2.2.1 Plackett-Burman試驗

采用響應面法對丁酸梭菌BLCC1-0022的培養基組成進行優化，PB試驗設計及結果見表5，效應分析見表6。

表5 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 5 Design and results of Plackett Burman tests

采用一階多項式模型對表5的試驗數據進行擬合，得到的一次線性回歸方程為：

Y=2.50+0.012A+0.031B+0.028C+0.013D+0.025E-0.050F-0.017G

由表6可知，丁酸梭菌BLCC1-0022發酵液活菌數響應值模型的調整決定系數R2Adj和決定系數R2均較高，表明模型擬合程度良好，分析結果具有一定的可信度。由表6亦可知，不同因素對活菌數的影響大小排序為蛋白胨＞CaCO3＞牛肉浸膏＞酵母浸膏＞可溶性淀粉＞MgSO4·7H2O＞MnSO4·H2O，且僅蛋白胨對丁酸梭菌BLCC1-0022活菌數有顯著影響（P＜0.05）。因此，可以考慮將蛋白胨作為主要因素進行響應面試驗。其中蛋白胨、CaCO3、牛肉浸膏、酵母浸膏、可溶性淀粉對丁酸梭菌BLCC1-0022活菌數的影響為正相關，MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的影響為負相關。因此，可以通過增大蛋白胨、可溶性淀粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、CaCO3的添加量和減少MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的添加量來提高丁酸梭菌發酵液活菌數，以達到最大響應值。

表6 Plackett-Burman試驗設計的因素水平及效應分析Table 6 Factors,levels and effect analysis of Plackett Burman experimental design

2.2.2 最陡爬坡試驗結果

由PB試驗線性回歸方程可知，F和G的系數分別為0.050和0.017，其比例大概為3∶1，即F每減少3個單位（%）、G減少1個單位（%）；A、B、C、E的系數分別為0.012、0.031、0.028和0.025，其比例大概為1∶2∶2∶2，即A每增加一個單位（%），B增加2個單位（%），C增加2個單位（%），E增加2個單位（%）。設計10個梯度，每個梯度2個平行的最陡爬坡試驗，試驗設計及結果見表7。

表7 最陡爬坡試驗設計及結果Table 7 Design and results of steepest climbing tests

由表7可知，第5組丁酸梭菌BLCC1-0022的活菌數最高，為5.67×108CFU/mL。因此，在后續的響應面分析試驗中以本試驗第5組為中心點進行響應面設計分析。

2.2.3 響應面試驗結果

根據PB及最陡爬坡試驗，以活菌數（Y）為響應值，選擇影響因素較大的且添加量相對較大的可溶性淀粉（X1）、蛋白胨（X2）、牛肉浸膏（X3）及CaCO3（X4）為考察因素進行響應面試驗，試驗因素與水平見表8，試驗設計及結果見表9，方差分析結果見表10。

表8 響應面試驗因素設計與水平Table 8 Factors and levels of response surface tests design

對表9的試驗數據進行多元二次回歸擬合，建立活菌數的回歸模型。回歸方程為Y=71.02+2.61X1+16.88X2+4.75X3+15.62X4-2.18X1X2-1.25X1X3+1.69X1X4+2.80X2X3+3.64X2X4-1.41X3X4-111.24X12-25.99X22-6.03X32-14.32X42。

表9 響應面試驗設計及結果Table 9 Design and results of response surface tests

由表10可知，模型擬合的決定系數（R2值）和校正決定系數（R2Adj值）分別為0.916 5和0.832 9，表明模型的擬合程度良好，可信度高。模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項P值為0.973 8，不顯著（P＞0.05），說明該模型可用。

由表10亦可知，各因素對丁酸梭菌活菌數影響的主次順序為蛋白胨＞CaCO3＞牛肉浸膏＞可溶性淀粉，即蛋白胨和CaCO3的影響最大，其次是牛肉浸膏，最后是可溶性淀粉，這與PB試驗結果一致。由回歸方程和方差分析還可知，模型中一次項X2和X4、二次項X22和X42對丁酸梭菌活菌數的影響極顯著（P＜0.01），二次項X12、X32影響顯著（P＜0.05），其他項影響不顯著（P＞0.05）。

表10 回歸模型的方差分析Table 10 Variance analysis of regression model

此模型計算出的可溶性淀粉（X1）、蛋白胨（X2）、牛肉浸膏（X3）、CaCO3（X4）的最優添加量分別為2.42%、3.27%、3.31%和2.47%，預測的響應值為6.987×108CFU/mL。為了驗證模型的有效性，采用最優培養基培養丁酸梭菌BLCC1-0022得到的活菌數實際值為6.721×108CFU/mL，芽孢率為98.21%，與預測值總體吻合，說明模型可靠。且優化后的培養基與原始培養基（增殖培養基）相比，活菌數提高了3.22倍，芽孢率提高了17%。與夏會麗等[3，15-16]的研究相比，簡化了培養基組分，顯著提高了性價比，這為下一步丁酸梭菌BLCC1-0022商業化應用奠定基礎[24-25]。因此，最終確定優化培養基配方為：可溶性淀粉2.42%、蛋白胨3.27%、牛肉浸膏3.31%、CaCO32.47%、MgSO4·7H2O 0.025%、MnSO4·H2O 0.025%。

3 結論

本試驗從四株丁酸梭菌出發，通過測定菌株產酸性能、產酶活力、抑菌性能和抗逆性等，篩選出生物學性能最優的丁酸梭菌BLCC1-0022，并以活菌數為響應值，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和響應面試驗得到其最優發酵培養基組成：可溶性淀粉2.42%、蛋白胨3.27%、牛肉浸膏3.31%、MgSO4·7H2O 0.025%、MnSO4·H2O 0.025%、CaCO32.47%。在最優發酵培養基下，丁酸梭菌BLCC1-0022活菌數為6.721×108CFU/mL，芽孢率為98.21%，與原培養基相比，分別提高了3.22倍、17%。