產(chǎn)香酵母的分離鑒定及對不同原料釀造甜酒香氣成分的影響

楊玉蓉，鐘海雁，徐帥哲，楊 寧，楊 濤*

（中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

甜酒又稱甜酒釀、醪糟等，甜酒具有看起來像米、盛起來像飯、喝起來像酒、滋味如蜜的特點[1]，不僅可以直接飲用，也可用于發(fā)酵食品如饅頭[2]、米發(fā)糕[3]等的制作。非釀酒酵母可用以提高酒的風味，尤其是提高揮發(fā)性香味物質的種類和含量，例如在葡萄酒風味提高研究中，具有高產(chǎn)酯能力的鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima）已經(jīng)是一種商業(yè)化的產(chǎn)香酵母[4]，貝酵母（Saccharomyces bayanus）用于增加蘋果白蘭地揮發(fā)性風味物質含量，起到酒體增香的作用[5]，扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）發(fā)酵能提高韓國米酒乙酯類芳香化合物的含量[6]，為提高傳統(tǒng)米酒的香氣品質，有研究表明從中國傳統(tǒng)甜酒曲中分離出的光滑假絲酵母（Candida glabrata）發(fā)酵后，具有豐富的酯類物質及較高的含量[7]，可見目前越來越多的研究關注到產(chǎn)香產(chǎn)酯酵母的菌種開發(fā)。

米酒中有幾十上百種風味物質，原料對風味物質的形成具有一定決定作用，稻米中含量最多的成分是淀粉，淀粉含量平均達60%以上[8]。大米中含量第二多的物質是蛋白質，未經(jīng)研磨的糙米蛋白質含量在7.1%～8.3%之間，精米中的蛋白質含量在6.3%～7.1%之間[9]。大米蛋白含量對米酒風味的形成起著關鍵的作用，這是因為根霉在米酒釀造過程中除了起到液化和糖化的作用，還起一個非常重要的作用——產(chǎn)蛋白酶，根霉所產(chǎn)的蛋白酶酶解大米蛋白后形成小分子的多肽和氨基酸，有利于提高米酒的營養(yǎng)價值和風味[10]。

“曲為酒之骨”，甜酒曲是釀造優(yōu)質甜酒的關鍵。但目前傳統(tǒng)甜酒曲多為家庭作坊手工制作，開放式培養(yǎng)，受氣候溫度的影響大，同時存在雜菌如致病菌的污染問題[11]，導致甜酒成品質量不穩(wěn)定、存在安全隱患；商品化甜酒曲釀造的甜酒成品質量穩(wěn)定，但酒香不足，甜度過高，多喝使人生膩。因此，為提高甜酒風味品質，本研究從傳統(tǒng)顆粒酒曲中分離篩選產(chǎn)香酵母，結合形態(tài)學觀察及分子生物學對篩選菌株進行鑒定，采用頂空-氣相色譜（head spacegas chromatography，HS-GC）法對篩選菌株產(chǎn)香能力進行測定，并考察產(chǎn)香酵母對不同原料釀造甜酒香氣成分的影響，旨在為甜酒釀造篩選產(chǎn)香菌株和優(yōu)良原料，以提高甜酒風味品質，為風味米酒開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株和原料

傳統(tǒng)顆粒甜酒曲：廣西梧州農(nóng)戶；米根霉（Rhizopus oryzae）MT835118：本實驗室保存；秈米（蛋白質含量7.2 g/100g、碳水化合物含量75 g/100 g、脂肪含量0.6 g/100g）：湖南洞庭春米業(yè)有限公司；秈糯米（蛋白質含量7.3 g/100 g、碳水化合物含量77.0 g/100 g、脂肪含量1.7 g/100 g）：安徽燕之坊食品有限公司。

1.1.2 化學試劑

乙酸乙酯（純度99.9%）、苯乙醇（純度99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸苯乙酯（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙醇（純度99.7%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；Ezup Column Fungi Genomic 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；高溫α-淀粉酶（酶活40 000 U/g）、葡萄糖淀粉酶（酶活100000U/g）：北京索萊寶科技有限公司；TaqPlus DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）：上海博微生物科技有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

米汁培養(yǎng)基：稱取100 g大米，蒸熟后加入0.3 g的高溫α-淀粉酶，90 ℃水浴鍋中液化1.5 h，100 ℃滅活10 min，再加入0.1 g葡萄糖淀粉酶，60 ℃水浴鍋中糖化1.5 h，4層紗布過濾，8 000 r/min離心10 min后，于121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

HS-10頂空進樣器、NexisGC-2030氣相色譜儀、SH-Rtx-1色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：日本島津公司；BA200顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；MIR-150A恒溫培養(yǎng)箱：上海SANTN公司；TD5A-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司、UV-2600紫外可見光分光光度計：日本島津公司、DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；Verity96well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；手持折光儀：艾普計量儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離和純化

將0.1 g酒曲加入到10 mL無菌水中梯度稀釋后，涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，挑取符合酵母菌落形態(tài)的單菌落，采用平板劃線法接種于YPD培養(yǎng)基，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，以上步驟重復3次，純化后得到純菌株。

1.3.2 分離菌株復篩

將篩選菌株置于米汁培養(yǎng)基中發(fā)酵，采用HS-GC法測定甜酒典型風味β-苯乙醇含量，從而篩選產(chǎn)香能力最好的菌株。

各取一環(huán)分離菌株接種于50 mLYPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌懸液的OD600nm值至1后，于米汁培養(yǎng)基中添加OD600nm值為1的各實驗菌株菌懸液0.8%（V/V），30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)72 h后，取發(fā)酵液用0.45 μm微孔濾膜過濾，1 mL濾液加入0.5 g NaCl后進樣檢測。

1.3.3 篩選菌株的鑒定

（1）形態(tài)學觀察

取一環(huán)純化后的菌，在YPD平板上平板劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察平板上單菌落的菌株菌落形態(tài)。用接種針沾取菌苔于載玻片上，滴加1滴無菌水，蓋上蓋玻片，于光學顯微鏡下10×40倍觀察菌株細胞形態(tài)。

（2）分子生物學鑒定

DNA提取：按Ezup Column Fungi Genomic DNA Purification Kit說明進行DNA提取，DNA提取液于-20 ℃保藏備用。通過PCR擴增菌株的內(nèi)部轉錄間隔（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域序列，引物為通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；或者26S rRNA D1/D2區(qū)，擴增常用通用引物為NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。

PCR擴增體系：2 μL 的20～50 ng/μL模板DNA，2 μL 的10 μmol/L ITS1或NL1，2 μL 的10 μmol/L ITS4或NL4，2 μL的10 μmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），0.5 μL的5 U/LTaqPlus DNA聚合酶，加入超純水補至50 μL。PCR擴增條件如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸2 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗其純度，電泳參數(shù)為150 V，100 mA，20 min。目的片段由生工生物工程（上海）股份有限公司進行一代測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中，用基于局部比對算法搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行基因序列的同源性檢索，通過與已知酵母菌的基因序列比對進行分類鑒定。若基因序列與已知菌種的基因序列堿基差異大于1%，則該菌株即為新菌種。采用ClustalW比對ITS序列，利用MEGAX軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法（Bootstrap值設為1 000）構建系統(tǒng)發(fā)育。

1.3.5 米粉曲制作

取一環(huán)米根霉接種于PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)至孢子成熟，再用0.05%的Tween-80沖洗培養(yǎng)基表面，洗下的孢子經(jīng)2層無菌擦鏡紙過濾，將得到孢子懸液濃度調(diào)至約107CFU/mL。菌株YRNN5接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h，稀釋后得約107CFU/mL的菌懸液。將大米磨粉過60目篩得到大米粉，取50 g大米粉分別加入3個500mL三角瓶中，115℃滅菌30 min，按米粉質量的2%將兩種菌懸液分別按米粉質量2%的添加量加入滅菌后的米粉中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，于35 ℃烘箱中干燥3 d，使水分含量低至14%以下，得到米根霉、菌株YRNN5的米粉曲，用于甜酒發(fā)酵。

1.3.6 菌株YRNN5發(fā)酵秈米酒、糯米甜酒分析檢測

各取40 g秈米和秈糯米，按1∶1.4（g∶mL）的比例加入無菌水，于115 ℃蒸煮30 min，得到秈米和秈糯米米飯。將根霉和YRNN5米粉曲分別按接種量0.8%接至無菌秈米和秈糯米米飯中，總米粉曲接種量為1.6%，于30 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵72 h，采用頂空氣相色譜聯(lián)用（HS-GC）法測定秈米和秈糯米甜酒關鍵香氣物質（β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯）差異。

HS-GC分析條件為：SH-Rtx-1色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），頂空加熱條件為：恒溫爐溫度60 ℃，恒溫時間22 min；進樣口溫度220 ℃，分流進樣，分流比1∶20，載氣為氮氣（N2），流量1 mL/min；升溫程序：35 ℃保持6 min，以5 ℃/min升溫至50 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速度升至160 ℃；檢測器溫度220 ℃。

β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯標準曲線繪制：用體積分數(shù)為10%的乙醇溶液配制不同質量濃度的β-苯乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯標準溶液，同時配制不同體積分數(shù)的乙醇溶液，分別以β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯標準曲線，β-苯乙醇標準曲線回歸方程為：y=34.33x-246.104，相關系數(shù)R2=0.997。得到乙醇標準曲線回歸方程為：y=3 821 829x+451 505，相關系數(shù)R2=0.999 2；乙酸乙酯標準曲線回歸方程為：y=1 497.95x-5 155.75，相關系數(shù)R2=0.999 8；乙酸苯乙酯標準曲線回歸方程為：y=156.88x-95.35，相關系數(shù)R2=0.999。按照標準曲線回歸方程計算發(fā)酵液β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量。

糖度的測定采用手持糖度計測定，取兩滴甜酒發(fā)酵液滴于檢測的折光棱鏡表面，將折光儀對準光源觀察目鏡，所視分界線所對應的刻度值即為所測溶液的糖度（°Bx）。

感官評價：參考國標GB/T 12313—1990《感官分析方法風味剖面檢驗》[12]加以修改，具體為采用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法，標度方法為線性標度法。左端代表“最弱”，右端代表“最強”，由6名本實驗室（20～27歲，3名女性，3名男性）經(jīng)過訓練的人員組成感官評價小組。發(fā)酵后的秈米和秈糯米甜酒各取5 g于品酒杯中，樣品溫度和室溫均在20～25 ℃，評價完成后，用直尺測量氣味描述的線性表度長度，采用得到的長度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 20.0軟件，繪圖采用Prism 8.0軟件，系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA X軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和純化

分離純化后得到純菌株6株，菌株分別命名為YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4、YRNN5、YRJM。

2.2 菌株復篩結果

β-苯乙醇是米酒的典型香氣物質之一，具有典型的玫瑰花香[13]，賦予米酒花香的特征。篩選菌株產(chǎn)β-苯乙醇能力測定結果見圖1。由圖1可知，篩選菌株在米汁培養(yǎng)基中發(fā)酵后，菌株YRNN5產(chǎn)β-苯乙醇量（19.06 mg/L）顯著高于其他5株酵母（P＜0.05），其次是菌株YRNN3，β-苯乙醇產(chǎn)量為11.74 mg/L，而其他菌株在米汁培養(yǎng)基中產(chǎn)β-苯乙醇的量均低于10 mg/L。因此，選取產(chǎn)香能力更強的菌株YRNN5作為甜酒增香酵母進行后續(xù)實驗。

圖1 篩選菌株產(chǎn)β-苯乙醇能力Fig.1 β-phenylethanol production ability of screened strain

2.3 菌種形態(tài)學鑒定

篩選菌株的菌落及細胞形態(tài)觀察結果見圖2。由圖2A可知，菌株YRNN1～YRNN5的菌落顏色為白色，菌落邊緣光滑無擴散，30 ℃培養(yǎng)48 h后菌落直徑為5 mm。由圖2B可知，菌株YRNN1～YRNN5具有兩種細胞形態(tài)類型，一種是單細胞酵母形態(tài)，另一種是菌絲狀酵母形態(tài)。菌株YRJM的細胞形態(tài)則呈現(xiàn)典型的釀酒酵母的卵圓形。該實驗結果與FARH M等[14]的研究結果類似，從不同Nuruk樣品中分離出的雙形態(tài)的酵母被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），該菌主要用于韓國米酒的發(fā)酵。

圖2 篩選菌株的菌落（A）及細胞（B）形態(tài)Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of screened strains

2.4 分子生物學鑒定

26S rRNA D1/D2區(qū)域具有較高的變異率，可用于親緣關系較近的菌株之間的分類研究[15]。核糖體重復單元的ITS區(qū)具有受環(huán)境因素影響小、進化速度快的特點，在相同種的不同菌株間高度保守，而在不同種間的差異極大，通常是應用于屬及屬以下的真菌分類學[16]。使用BLAST對6株酵母的擴增產(chǎn)物測序得到序列與相關菌株的序列進行比較，結果見表1。

由表1可知，菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5與S.fibuligeraADJ4、KJJ81和ATCC36309的親緣關系最近，且序列相似度達99%以上，菌株YRJM與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RG15和RG20的序列相似度為100%。

表1 6株篩選菌BLAST比對結果Table 1 BLAST comparison results of 6 screened strains

為進一步可視化菌株與其相似菌株之間的親緣關系，采用MEGA X軟件構件6株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains YRNN1,YRNN2,YRNN3,YRNN4 and YRNN5

由圖3可知，菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsisfibuligera），NCBI登記號分別為MT831527、MT831528、MT831529、MT831530和MN809231。菌株YRJM的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，菌株YRJM與S.cerevisiaeRG15的bootstrap值為100，被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），NCBI登記號為MT830867。

圖4 菌株YRJM的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YRJM

2.5 秈米和秈糯米甜酒風味

以菌株YRNN5作為甜酒增香酵母分別發(fā)酵秈米和秈糯米，所得甜酒風味輪廓見圖5。由圖5可知，秈米和秈糯米的風味輪廓有明顯的區(qū)別，體現(xiàn)在秈糯米甜酒的甜滋味更為突出。秈米甜酒雖然甜滋味不夠突出，但花香、果香和蜜香得分更高，整體風味更為突出。

圖5 菌株YRNN5發(fā)酵秈米和秈糯米制備甜酒風味輪廓圖Fig.5 Flavor profile of indica rice and indica glutinous rice wine fermented by strain YRNN5

選取具有果香特征的乙酸乙酯[17]、具有舒適花香和蜜香特征的β-苯乙醇[18]和乙酸苯乙酯[19]作為風味物質含量評價指標，經(jīng)HS-GC測定風味物質含量，秈米和秈糯米甜酒風味物質測定結果見表2。由表2可知，秈米甜酒和秈糯米甜酒的乙醇含量分別為15.15%vol和12.80%vol，無顯著性差異（P＞0.05）。乙酸乙酯含量差異不顯著（P＞0.05），但秈米甜酒的乙酸乙酯含量為70.42 mg/L，高于秈糯米甜酒的47.01 mg/L。這可能與秈米甜酒和秈糯米甜酒乙醇含量差異不顯著有關，因為乙酸乙酯主要是在醇乙酰基轉移酶的催化下由乙酸和乙醇脫水縮合形成[20]。秈米和秈糯米甜酒的β-苯乙醇含量分別為771.38 mg/L和433.07 mg/L，差異顯著（P＜0.05），秈米甜酒的β-苯乙醇含量高于秈糯米甜酒。該結果與油卉丹等[21-22]的研究結果類似。貴州和海南的地方標準[23-24]對發(fā)酵米酒中的β-苯乙醇都有最低含量標準（4～20 mg/mL）。秈米和秈糯米甜酒的乙酸苯乙酯含量也具有顯著性差異（P＜0.05），乙酸苯乙酯含量分別為2.90 mg/L和1.33 mg/L。乙酸苯乙酯可經(jīng)酯酶催化乙酸與β-苯乙醇形成，或是經(jīng)醇酰基轉移酶催化乙酰輔酶A和β-苯乙醇形成[25]，β-苯乙醇是乙酸苯乙酯形成的必要底物之一，因此秈米甜酒和秈糯米甜酒中乙酸苯乙酯含量的差異可能與β-苯乙醇含量高低有關。趙婷婷等[26]研究表明，β-苯乙醇和乙酸苯乙酯是米酒的主體香成分，通過測定典型甜酒香風味物質乙酸乙酯、β-苯乙醇和乙酸苯乙酯含量和感官評價，表明秈米甜酒的風味要高于秈糯米甜酒。

表2 秈米和秈糯米甜酒關鍵風味物質差異Table 2 Differences in key flavor compounds between sweet wine of indica rice and indica glutinous rice

3 結論

該研究本實驗從土曲中分離出6株酵母，其中5株菌（編號為YRNN1～YRNN5）被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和菌株YRJM被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株YRNN5產(chǎn)β-苯乙醇最高（22.98 mg/L），將其作為甜酒增香菌株應用于不同原料釀造甜酒。甜酒香氣成分分析結果表明，秈米甜酒的β-苯乙醇和乙酸苯乙酯含量分別為771.38 mg/L、2.90 mg/L，顯著高于秈糯米甜酒（P＜0.05），秈米甜酒和秈糯米甜酒的乙醇含量分別為15.15%vol和12.80%vol，無顯著性差異（P＞0.05）。本研究篩選出的扣囊復膜酵母產(chǎn)β-苯乙醇能力優(yōu)于釀酒酵母，能提高甜酒的典型的蜜香和花香，秈米甜酒的整體風味優(yōu)于秈糯米甜酒，菌株YRNN5和秈米可以作為甜酒發(fā)酵的產(chǎn)香酵母和優(yōu)良原料。