D-阿洛酮糖合成及偶聯釀酒酵母發酵的研究

姜彥君，張麗華，李 楠，李丕武，王瑞明，隋松森，郭傳莊，王建彬，李俊霖，李小雙，連 戰，劉思奇，張晨曦，汪俊卿*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250300；2.諸城東曉生物科技有限公司，山東 濰坊 261000）

D-阿洛酮糖（D-allulose）是D-果糖在C3位的差向異構體[1]。D-阿洛酮糖是白色的粉末狀晶體，無臭并且不易吸潮，易溶于水[2]，其甜度可以代替蔗糖作為Ⅱ型糖尿病人的甜味劑和膳食補充劑[3]。D-阿洛酮糖具有預防保護神經、治療神經變性的作用[4]。其熱量低，可以有效抑制血脂和血糖的升高[5]，具有調節血糖穩定等特殊功能，是近幾年來發現的一種具有特殊保健功能[6]胞內產物。

D-阿洛酮糖在自然界中的含量很少，通過人工合成的方法可以大規模生產，合成方法主要有兩種：化學法和生物法。D-阿洛酮糖可以利用鉬酸離子催化劑催化D-果糖合成D-阿洛酮糖[7]，也可以加熱乙醇和三乙胺合成得到D-阿洛酮糖[8]。化學法合成D-阿洛酮糖目前較為困難，尚未取得突破性進展，由此可以借鑒化學法合成稀少糖的方式合成D-阿洛酮糖。ANDREANA P R等[9-10]報道了一種通過關環轉換合成稀少糖的方法，該反應相對簡單，但只能產生3,4位順式的稀有糖衍生物，還伴隨產生烯烴物。NORTHRUP A B等[11]提出了兩步法，通過選擇性醇醛縮合合成糖類化合物，但在大規模生產中具有一定的局限性。化學法合成步驟復雜不可控、轉化效率低，而市場對于D-阿洛酮糖的需求量和品質的要求越來越高，通過生物法生產D-阿洛酮糖成為該領域的研究熱點。日本香川大學Izumori團隊首次提出產堿桿菌屬細菌能夠以半乳糖醇、阿洛糖醇或D-塔格糖作為底物生產D-阿洛酮糖[12]。黃擎宇等[13]則是利用生物反應器的原理大規模生產D-阿洛酮糖。相比于化學法，生物法具有高度的專一性，反應條件和純化步驟較為簡單，也是國內外研究生產D-阿洛酮糖的主要方法。與國外研究現狀相比，國內的研究起步較晚，但近年來通過生物法催化合成D-阿洛酮糖的研究也有了較大進展，主要有中糧營養健康研究院、江南大學等團隊針對D-阿洛酮糖進行研究，其內容涵蓋了產業化技術開發的各關鍵環節[14]。

通過生物合成法，以D-果糖為底物合成D-阿洛酮糖得到混合糖液，即為轉化液，粗樣品需要經過分離純化得到純度較高的D-阿洛酮糖。阿洛酮糖的分離純化方法主要有兩種，分別是直接分離法和間接分離法。直接分離法，如模擬移動床（simulated moving bed，SMB）[15]和色譜分離技術，其中SMB是一種利用色譜柱的吸附原理將液體進行分離操作的設備。色譜分離技術是利用不同物質在固定相和流動相中分配系數差異來分離混合物，混合糖液分別通過再生好的陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂脫色脫鹽，再通過帶有恒溫夾套的DTF-Ca2+型色譜分離樹脂分離純化，用分部收集器對樣品進行洗脫[16-17]。但由于D-果糖與D-阿洛酮糖的性質極為接近，因此使用色譜分離技術對D-果糖與D-阿洛酮糖進行直接分離難度較高。間接分離法，即利用微生物或酶對D-果糖進行轉化消耗，降低D-阿洛酮糖的分離難度。如SONG Y等[18]利用發酵法，對蔬菜的殘渣進行水解，經D-阿洛酮糖3-差向異構酶（D-allulose-3-epimerase，DAEase）催化后，利用釀酒酵母厭氧發酵消耗混合糖液中的D-果糖，在分離出D-阿洛酮糖的同時得到乙醇。LI Z J等[19]則使用兩步法酶催化反應，利用葡萄糖異構酶和葡萄糖氧化酶將混合糖液中的D-果糖轉化為葡萄糖酸，再利用離子交換樹脂分離葡萄糖酸，以乙醇為D-阿洛酮糖的結晶體系[19-20]，可以得到純度較高的D-阿洛酮糖。上述分離方法雖然對D-果糖進行了消耗，但會引入新的物質，對后續的分離純化造成一定的影響。另外，可以利用酵母的代謝特異性去除發酵產物中的雜糖，具有耗時短，安全性高，價格低廉，操作工藝、設備要求簡單的特點，有利于中下游分離純化，易于工業化[21-22]，如王秀娟等[23-24]分別采用釀酒高活性干酵母發酵法去除木糖母液中的葡萄糖，提高其中木糖及阿拉伯糖的純度，以便進行后續分離，在最適條件下，葡萄糖濃度降至0.2%以下。曹如燕等[25]采用面包酵母發酵法對蛋清進行脫糖處理，脫糖率可達95%以上。本研究利用含有組成型啟動子的質粒pET-20b作為載體，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中對3種D-阿洛酮糖3-差向異構酶進行異源表達，其后以D-果糖為底物進行靜息細胞轉化。同時為降低D-果糖對D-阿洛酮糖純化過程中的影響，在產糖后偶聯釀酒酵母好氧發酵，相比于酵母的厭氧發酵產CO2和乙醇，偶聯釀酒酵母好氧發酵的產物為CO2和水，不產生額外的物質，針對D-阿洛酮糖的深入研究，為下游D-阿洛酮糖的分離和純化提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要質粒、菌株和引物

Escherichia coliBL21（DE3）：北京全式金生物技術有限公司；pET20b-DPE1、pET20b-DPE2 和pET20b-DPE3 質粒：生工生物工程有限公司。pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3的大小分別為4 500 bp、4 509 bp和4 515 bp。以Nde I和BamH I作為基因的載體插入位點，連接后分別轉化到大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中。得到E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3。其中基因DPE1、DPE2、DPE3的來源分別為土壤農桿菌（Agrobacteriumsp.）、類芽孢桿菌（Paenibacillus senegalensis）和斑葉黃酮菌（Flavonifractor plautii）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

1.1.2 化學試劑

限制性內切酶BamH I（10 U/μL）、Nde I（10 U/μL）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；果糖（質量濃度為100 g/L）、氨芐青霉素（質量濃度為100 mg/mL）：北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）、氯化鈉（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒、三色預染蛋白Marker（10～250 kDa）：上海雅酶生物科技有限公司；質粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；超高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

種子培養基采用LB液體培養基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。121 ℃滅菌20 min。

含氨芐青霉素LB平板：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L。121 ℃滅菌20 min，晾涼后加入0.1%氨芐青霉素。在無菌環境下分裝添加了抗生素的培養基至培養皿內，厚度約為2～3 mm，約為15 mL固體培養基。其中每個培養皿中的成分和含量依次是酵母浸粉0.075 g，蛋白胨0.15 g，NaCl 0.15 g，氨芐青霉素100 μg/mL。

發酵培養基：酵母浸粉20 g/L，蛋白胨20g/L，糊精20 g/L。115 ℃滅菌20 min。

滅菌后的發酵培養基中經無菌操作分別加入經過單獨滅活的無機鹽A（20%）、B（0.20%）、C（0.20%），其中無機鹽為：KH2PO43.0 g，Na2HPO412.8 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，溶于200 mL的水中；無機鹽B：MgSO4·7H2O 2.4 g，溶于10 mL的水中；無機鹽C：CaCl20.11 g，溶于10 mL的水中。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；Applied BiosystemsTMVeritiTM96 孔熱循環儀、Applied BiosystemsTMMiniAmpTM熱循環儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Z326K高速離心機：德國Hemeus公司；D3024 臺式高速微量小型離心機：大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；DYY-12核酸電泳儀：北京六一生物科技有限公司；JY300C蛋白質電泳儀：北京君意東方電泳設備有限公司；ZQZY-70BS振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；ESSENTIAL V6凝膠成像系統：英國UVItec公司；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；Hi-Plex Ca色譜柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

取1 mL待測樣品于1.5 mL離心管內，在轉速5 000 r/min條件下離心2 min，取上清液稀釋10倍，取1 mL于1.5 mL針管內，濾膜過濾置于樣品瓶中，進行高效液相色譜分析。

1.3.2 質粒pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3的構建

以pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3質粒作為模板，設計含有Nde I和BamH I酶切位點的引物DPE1-F和DPE1-R、DPE2-F和DPE2-R、DPE3-F和DPE3-R，分別擴增3種D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因序列，通過Nde I和BamH I連接pET-20b，構建獲得3個不同的質粒pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30個循環；72℃延伸10min，4 ℃保存。

1.3.3 大腸桿菌的轉化及抗性篩選

在冰上融化感受態細胞，取5 μL質粒加到25 μL的感受態中，混勻。冰浴30 min，42 ℃水浴，熱激45 s，迅速轉至冰浴1 min，過程中避免振動。加入800 μL LB液體培養基，37 ℃培養45 min。分別將E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB冷平板上。將平板倒置，放到37℃恒溫培養箱中過夜培養。在含有氨芐青霉素的培養基上長出菌落即為成功轉入抗性質粒。

1.3.4 大腸桿菌工程菌的發酵和制備方法

將25 mL種子培養基裝于250 mL錐形瓶中，按1%（V/V）接種量從E.coliBL21-DPE1甘油管接種至種子培養基，搖床培養溫度為37 ℃，轉速200 r/min，連續培養16 h后，得種子液。將種子液按2%的接種量接種至發酵培養基，搖床培養溫度為30 ℃，轉速200 r/min，培養48 h，得發酵液。

取50 mL帶菌發酵液離心，轉速12 000 r/min離心5 min，留取菌體，加入50 mL pH 8.0的KOH緩沖液（含200 g/LD-果糖），懸浮菌體。在50 ℃水浴反應10 h，每小時取樣1 mL，稀釋10倍，進行HPLC檢測，測定D-阿洛酮糖含量。

1.3.5D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性的測定

D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性采用高效液相色譜法。高效液相色譜條件：Hi-Plex Ca色譜柱（300 mm×7.7 mm，8μm）；流動相為超純水，預先超聲排除空氣；流速0.6mL/min；柱溫箱溫度80 ℃；檢測器為示差折光檢測器；溫度40 ℃；進樣量10 μL。

樣品前處理：100 μL待測樣品與900 μL 50 mmol/L濃度的緩沖液（pH 8.0，含100 g/LD-果糖）充分混合后，55 ℃水浴反應10 min，反應結束后轉至沸水中滅活5 min。將煮沸后的菌液，12 000 r/min離心10 min，上清液稀釋10倍，用13 mm×0.22 μm的水系濾器過濾去除雜質后，轉移到樣品瓶中，進樣10 μL，HPLC分析D-果糖和D-阿洛酮糖的濃度。

定性定量方法：根據D-阿洛酮糖的保留時間定性，采用外標法定量。

D-阿洛酮糖3差向異構酶酶活定義：在55 ℃，pH 8.0的條件下，每分鐘生成1 μmolD-阿洛酮糖即為一個酶活單位（IU/mL）。

酶活計算公式如下：

式中：m為HPLC進樣10 μL樣品中D-阿洛酮糖的含量，mg；進樣量為100 μL；稀釋倍數為10；μL換算mL乘以1 000；D-阿洛酮糖的分子質量為180.16；反應時間為10 min。

D-果糖轉化率計算公式如下：

1.3.6 轉化液偶聯酵母好氧發酵

干酵母活化方法：2%果糖與純水混合液，加5%干酵母，38 ℃水浴15 min，再于30 ℃搖床中，以100 r/min活化2 h，即為酵母活化液。將此酵母活化液5 000 r/min離心10 min，棄上清，蒸餾水洗酵母后再次離心，收集酵母泥備用。

在50 ℃水浴條件下，大腸桿菌利用D-果糖10 h后加入1%～2%的酵母菌泥，在35 ℃、pH 4.5的條件下發酵14 h，發酵過程中每2 h取一次樣，采用HPLC法測定分析D-果糖和D-阿洛酮糖的含量。

2 結果與分析

2.1 重組菌大腸桿菌BL21（DE3）-DPE的驗證

3個重組菌的PCR驗證結果見圖1。由圖1可知，目的片段大小分別為872 bp、879 bp、885 bp，與目的基因大小相符說明目的基因均已成功轉化入E.coliBL21(DE3)中。

圖1 PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products

2.2 SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析

為驗證pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3在E.coliBL21（DE3）中是否正確表達，對發酵培養破碎后的重組大腸桿菌細胞進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測分析結果見圖2。由圖2可知，發酵后的重組大腸桿菌在32 kDa左右處有目的條帶，與目的蛋白的分子質量一致，SDS-PAGE結果證明了D-阿洛酮糖3-差向異構酶DPE1、DPE2和DPE3在E.coliBL21（DE3）中均已正確表達。

圖2 重組大腸桿菌SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant Escherichia coli cells

2.3 D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性及果糖轉化分析

采用HPLC方法對E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3細胞中的D-阿洛酮糖3-差向異構酶酶活進行測定，結果見圖3。由圖3可知，E.coliBL21-DPE1的D-阿洛酮糖3-差向異構酶酶活性最高，為10.18U/mL，E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3的酶活分別為3.06 U/mL、6.48 U/mL。

圖3 D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性及果糖轉化分析Fig.3 Analysis of the activity and fructose conversion of D-allulose 3-heteroisomeras

離心收集含有D-阿洛酮糖3-差向異構酶的細胞E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3，并對各含有D-阿洛酮糖3-差向異構酶的菌體的轉化率進行分析，經55 ℃水浴轉化10 h后，每1 h取樣，結果見圖3。由圖3可知，0～3 h時，果糖不斷減少，酮糖不斷增加，轉化率升高。4 h以后轉化率基本達到平穩狀態。其中E.coliBL21-DPE1轉化率最高為27.56%，E.coliBL21-DPE2轉化率最高為23.99%，E.coliBL21-DPE3轉化率最高為25.98%。考慮到E.coliBL21-DPE1具有最高的轉化率，后續偶聯釀酒酵母發酵時采用E.coliBL21-DPE1的轉化液進行進一步轉化。

2.4 轉化液偶聯酵母發酵分析

轉化液偶聯酵母發酵分析結果見圖4。

圖4 轉化液偶聯酵母發酵分析Fig.4 Transfer liquid-coupled yeast fermentation analysis

由圖4可知，加入2%酵母菌泥后，前8 h 酵母消耗D-果糖較慢，轉化8 h后，酵母快速消耗D-果糖，而在發酵培養過程中，幾乎不消耗酮糖，質量濃度保持在54 g/L左右，而經24 h 轉化后，D-果糖質量濃度降低至7.71 g/L，D-阿洛酮糖的質量濃度則由初始的28.33%提高至87.54%，D-果糖轉化轉化后的D-果糖率達到94.22%。

3 結論

本研究經基因克隆得到pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3這三個質粒，通過電轉化將三個質粒導入E.coliBL21（DE3）中，得到重組菌E.coliBL21-DPE1、E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3。經活性分析發現，E.coliBL21-DPE1的酶活性最高為10.18 U/mL，E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3的酶活分別為3.06 U/mL、6.48 U/mL。其中E.coliBL21-DPE1轉化率最高為27.56%，E.coliBL21-DPE2和E.coliBL21-DPE3的轉化率分別為23.99%和25.98%，由此可以看出E.coliBL21-DPE1的優勢遠高于其他兩種基因。與此同時偶聯酵母菌發酵，消耗混合糖液D-果糖和D-阿洛酮糖中的D-果糖，D-果糖去除率達到94.22%，增加D-阿洛酮糖的相對含量，為推進下游D-阿洛酮糖的純化提供新思路，對推動工業化大規模生產，豐富功能性稀有糖市場具有重要的意義。