高效降解生物胺乳酸菌的篩選、鑒定及特性研究

柳佳娜，張 賓，劉 宇，鄧尚貴，周小敏，姜 維*

（1.浙江海洋大學 食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大學 創新應用研究院，浙江 舟山 316022；3.浙江興業集團有限公司，浙江 舟山 316020）

生物胺是一類具有生物活性的含氮有機化合物的總稱，主要是氨基酸脫羧酶對游離氨基酸脫羧反應的產物[1-2]。人體內的微量生物胺具有重要的生理功能，但自身合成的量就能滿足需要，一般不需要外源攝入[3]。當人體攝入少量生物胺，可通過體內的胺氧化酶進行降解，如果攝入量超過人體自身的降解能力，會導致臉紅、嘔吐、呼吸加快、支氣管痙攣、頭痛以及高血壓等中毒癥狀。對先天性生物胺解毒能力低，或因飲酒、服用藥物等導致暫時性缺失生物胺解毒能力的人群，攝入少量生物胺即產生中毒癥狀。

生物胺在食品中廣泛存在，常見的有組胺、酪胺、腐胺和尸胺等，已經在酒類[4]、肉制品[5]、水產品[6]、乳制品[7]和調味品[8]中檢測到較高濃度的生物胺。減少食品中的生物胺主要有兩條途徑：抑制生物胺的產生和去除已產生的生物胺。目前，絕大部分研究集中在抑制生物胺的產生，生物胺的產生需要滿足三個條件：①游離氨基酸；②產氨基酸脫羧酶的微生物；③適宜微生物產氨基酸脫羧酶及氨基酸脫羧酶發揮作用的環境。采用輻照[9]、超高壓[10]、添加劑[11-12]和氣調包裝[13]等技術，可以有效抑制生物胺產生菌的生長或降低氨基酸脫羧酶的活性，從而減少生物胺的產生，但難以應用到需要微生物的發酵類食品中。

生物胺性質穩定，去除已經產生的生物胺是生物胺控制的難點。研究表明，采用胺氧化酶可以分解食品中的生物胺，但成本較高，短期內難以產業化推廣應用[14]。采用生物胺降解菌是去除食品尤其是發酵食品中生物胺的重要途徑之一，研究人員已經分離出多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）[15-16]、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）[17]、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[18]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[19]等生物胺降解菌，但數量不多。不同生物胺降解菌的生長和生物胺降解特性差異較大，實際應用中往往需要考量其與生產過程在溫度、酸堿度和鹽度等方面的匹配度，以及對食品風味和品質等方面的影響，以期挑選出符合要求的生物胺降解菌作為發酵劑。因此，有必要篩選高效降解生物胺的微生物，并明確其生長和生物胺降解特性，提高特定應用場景中生物胺降解菌的選擇范圍。

本研究以不同發酵時期的魚露為原料，采用化學成分限定培養基（chemical defined medium，CDM）選擇性富集、分離和純化乳酸菌，通過高效液相色譜法篩選高效生物胺降解乳酸菌，確定降解菌株的分類學歸屬，并研究其生長和生物胺降解特性，以期為發酵食品中生物胺控制提供有應用潛力的功能發酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

不同發酵時期（0.5、1、3和6個月）的魚露：浙江興業集團有限公司。

1.1.2 化學試劑

標準品腐胺、尸胺、組胺、酪胺和衍生劑丹磺酰氯：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；甲醇（色譜純）：默克生命科學技術（南通）有限公司；API50CH和API 50CHL鑒定試劑條：梅里埃診斷產品（上海）有限公司；鹽酸、丙酮、硝酸銀等其他化學試劑：國藥集團化學試劑有限公司。除特殊說明外，所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

參考文獻[20]方法制備用于乳酸菌培養的CDM液體培養基，并使用4種生物胺代替硫酸銨，腐胺100 mg/L，尸胺100 mg/L，組胺100 mg/L，酪胺100 mg/L，固體培養基中添加2%瓊脂。

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；JXDC-20氮吹儀：上海凈信實業發展有限公司；H2050R高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；DW-86L388超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；CX41生物纖維鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；UV2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；DH6000BⅡ電熱恒溫培養箱：天津泰斯特儀器有限公司；BSC-150恒溫恒濕箱：上海博迅實業有限公司；Milli-Q超純水系統：密理博（上海）貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物胺的測定

采用丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色譜法測定生物胺含量[21]。

1.3.2 生物胺降解乳酸菌的富集、分離與純化

1 g魚露樣品加入到20 mL的CDM液體培養基（NaCl含量3%）中，37 ℃條件下靜置富集培養48 h，稀釋100～104倍后取0.1 mL分別涂布于CDM瓊脂培養基（NaCl含量3%）平板，37 ℃下培養48 h，分離挑選單菌落，在CDM瓊脂培養基（NaCl含量3%）平板上4次劃線純化，對純化后微生物編號，添加20%甘油后保藏于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 乳酸菌的生物胺降解能力評價

2%乳酸菌（V/V）接種于MRS肉湯培養基（NaCl含量3%）中，37 ℃條件下靜置培養24 h，4 ℃、8 000×g離心10 min收集菌體。0.05 mol/L pH=6.0磷酸鹽緩沖液（NaCl含量3%）洗滌兩次，將菌體重懸到含腐胺、尸胺、組胺和酪胺各100 mg/L的上述磷酸鹽緩沖液中，調整菌濃度為OD600nm值=0.8。取8 mL菌懸液加入到10 mL培養管中，37 ℃條件下靜置保持24 h。不添加菌體的含生物胺上述磷酸鹽緩沖液在同樣條件下保持24 h，作為對照組。測定對照組和實驗組上清液中的4種生物胺含量，生物胺降解率計算公式如下：

1.3.4 乳酸菌產生物胺能力評價

將2%乳酸菌（V/V）接種于MRS肉湯培養基（NaCl含量3%和鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸各300 mg/L）中，37 ℃條件下靜置培養48 h。不接種乳酸菌的培養基在同樣條件下保持48 h，作為對照組。測定實驗組和對照組的生物胺含量，乳酸菌產生物胺能力為實驗組的生物胺含量減去對照組生物胺含量。經過比較，選擇降解組胺、尸胺、腐胺和酪胺能力強且本身不產該4種生物胺的菌株，作為本研究的高效降解生物胺乳酸菌。

1.3.5 菌株FSCBAD033的鑒定

使用API50CH和API 50CHL檢測菌株對49種不同碳源的發酵能力。將菌株涂布接種于MRS瓊脂培養基（NaCl含量3%）上，37 ℃條件下培養24 h后觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色。

分子生物學鑒定：委托上海生工生物工程技術服務有限公司提取菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），擴增16SrRNA序列并進行測序。測出的16SrRNA基因序列提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫，獲得登錄號。在EzBioCloud平臺上比較菌株與其他標準菌株的16S rRNA序列相似性[22]。選擇相似度高的屬內和屬間序列，使用MEGA 11軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，自舉法（bootstrap）對系統發育樹進行檢驗（重復1 000次），確定菌株FSCBAD033的種屬關系。

1.3.6 菌株FSCBAD033生長曲線的繪制及環境因素對菌株生長的影響

接種環挑取少量斜面保存的菌株FSCBAD033于20 mL MRS肉湯培養基（NaCl含量3%）中，37 ℃下活化培養12 h。取活化好的種子液按照2%的接種量接種于MRS肉湯培養基（NaCl含量3%）和含生物胺MRS肉湯培養基（NaCl含量3%和腐胺、尸胺、組胺、酪胺各100 mg/L），37 ℃條件下靜置培養24 h，間隔時間測定波長600 nm下的吸光度值作為生物量，繪制生長曲線。

參照上述步驟，在MRS肉湯培養基中：在初始pH值6.0和NaCl含量3%的條件下，依次考察溫度（5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、初始pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）、NaCl含量（0、1%、2%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30%）對菌株FSCBAD033生長的影響。

1.3.7 菌株FSCBAD033去除生物胺作用方式分析

按照1.3.3的方法制備洗滌兩次后的菌體，將菌體重懸到0.05 mol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖液（NaCl含量3%）中，調整菌液濃度為OD600nm值=0.8，取部分菌懸液121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。向滅活和未滅活的菌懸液中分別加入四種混合生物胺，使各生物胺的終質量濃度均為100 mg/L，37 ℃下保持24 h。不添加菌懸液的含生物胺磷酸鹽緩沖液在同樣條件下保持24 h，作為對照組。測定滅活菌實驗組、未滅活菌實驗組和對照組上清液中的生物胺含量，分析生物胺的脫除是物理吸附還是生物降解作用。生物胺脫除率計算公式如下：

1.3.8 菌株FSCBAD033對混合生物胺的降解動力學研究

按照1.3.3的方法，在0.05 mol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖液（含3% NaCl和腐胺、尸胺、組胺、酪胺各100 mg/L），37 ℃條件下靜置保持24 h，不添加菌體的含生物胺上述磷酸鹽緩沖液在同樣條件下保持24 h作為對照組，間隔3 h取樣，測定生物胺降解率，繪制菌株對混合生物胺的降解動力學曲線。

1.3.9 環境因素對菌株降解生物胺的影響

參考1.3.3的方法，在初始pH值6.0和NaCl含量3%的條件下，考察溫度（5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、初始pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）、NaCl含量（0、1%、2%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30%）對菌株降解四種生物胺的影響。

1.3.10 數據處理與分析

采用Excel2019軟件處理數據，采用Origin 9.0軟件繪圖，結果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離

通過選擇性富集、分離和純化，從魚露樣品中共分離到42株乳酸菌菌株（編號FSCBAD001～FSCBAD042），來源見表1。由表1可知，發酵時間長的魚露樣品中分離到的乳酸菌菌株相對更多。

表1 發酵魚露樣品中分離到的乳酸菌菌株Table 1 Lactic acid bacteria strains isolated from fish sauce samples

2.2 生物胺降解乳酸菌的篩選

采用含生物胺菌懸液培養法，評價了42株乳酸菌菌株的生物胺降解能力，結果見表2。其中，8株乳酸菌表現出對腐胺、尸胺、組胺和酪胺中一種或多種生物胺的降解活性，未檢測到其余34株乳酸菌對該4種生物胺的降解活性。有2株乳酸菌（FSCBAD006和FSCBAD033）對4種生物胺均有降解活性，且菌株FSCBAD033的活性明顯高于菌株FSCBAD006，降解了86.4%腐胺、78.5%尸胺、72.3%組胺和100%酪胺。其余6株乳酸菌可以降解2～3種生物胺，其中，菌株FSCBAD018降解89.4%尸胺，菌株FSCBAD022降解100%酪胺，FSCBAD038菌株降解80.6%腐胺和65.2%尸胺，這些菌株對特定生物胺表現出較好的降解活性。

表2 乳酸菌菌株降解生物胺能力的比較Table 2 Comparison of biogenic amines degradation ability by different lactic acid bacteria strains

采用含生物胺前體氨基酸培養基培養法，評價了8株生物胺降解乳酸菌的產生物胺能力，結果見表3。由表3可知，除菌株FSCBAD006和FSCBAD033外，其余6株乳酸菌均具備產生物胺的能力，不宜作為生物胺降解功能菌。此外，本研究還發現，具備降解特定生物胺的菌株均未觀察到產該生物胺的能力，與以往的研究報道相符，這也有可能是因為菌株自身將已經產生的生物胺再次降解[21，23-24]。

表3 生物胺降解乳酸菌菌株產生物胺能力的分析結果Table 3 Analysis results of the biogenic amines forming ability of biogenic amines degrading lactic acid bacteria strains

綜上，分離自發酵6個月魚露樣品中的菌株FSCBAD033，對食品中4種常見生物胺（腐胺、尸胺、組胺和酪胺）表現出高效的降解能力，且在含有前體氨基酸的培養基中不積累該4種生物胺，進一步根據文獻[21]方法分析菌株FSCBAD033產色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺的能力，發現其不產上述4種生物胺。因此，選擇菌株FSCBAD033為本研究的高效生物胺降解菌。

2.3 生物胺降解菌株FSCBAD033的鑒定

2.3.1 菌落形態及生理生化試驗

菌株FSCBAD033的菌落呈圓形乳白色、表面光滑、中間凸起，革蘭氏陽性，細胞呈短桿狀，API 50CH和API 50CHL分析結果表明，菌株FSCBAD033可以利用阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、核糖、蔗糖、海藻糖和木糖。

2.3.2 菌株的分子生物學鑒定

將菌株FSCBAD033的16S rRNA基因序列提交至NCBI Genbank，獲得登錄號MW642087，在EzBioCloud平臺上分析菌株FSCBAD033的16S rRNA基因序列與其他標準菌株相似度，發現與發酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）CECT 562T的相似度最高（99.80%）。選擇16S rRNA基因序列相似度較高的乳桿菌科（Lactobacillaceae）檸檬桿菌屬（Limosilactobacillus）菌株以及乳桿菌科其他兩個屬菌株的16S rRNA基因序列，與菌株FSCBAD033的16S rRNA基因序列構建系統發育樹見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列菌株FSCBAD033的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain FSCBAD033 based on 16S rRNA gene sequences

由圖1可知，菌株FSCBAD033與L.fermentumCECT 562T聚為一支，并且明顯區別于其他菌株，從分子生物學上可將菌株FSCBAD033歸類為L.fermentum。2020年，原發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）被重新分類為發酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）[25-26]。因此，菌株FSCBAD033被鑒定為發酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）。

2.4 菌株FSCBAD033的生長特性研究

2.4.1 菌株FSCBAD033的生長曲線

菌株FSCBAD033在MRS培養基（含3%NaCl）和含生物胺MRS培養基（含3%NaCl和腐胺、尸胺、組胺和酪胺各100 mg/L）的生長曲線見圖2。

圖2 發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033的生長曲線Fig.2 Growth curve of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

由圖2可知，將菌株FSCBAD033按照2%（V/V）接種到不含生物胺的MRS培養基中，在37 ℃條件下靜置培養，接種后4 h進入對數生長期，16 h進入穩定期，最大生物量（OD600nm值）為1.728。菌株FSCBAD033按照2%（V/V）接種到含有4種生物胺的MRS培養基中，接種后6 h進入對數生長期，18 h進入穩定期，最大生物量（OD600nm值）為1.624。因此，生物胺通過延長遲滯期和降低對數期生長速率的方式，一定程度上抑制了菌株FSCBAD033的生長，可能是因為生物胺會對細胞產生一定的毒性，導致細胞的凋零或死亡[27-28]。

2.4.2 溫度對菌株FSCBAD033生長的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，菌株FSCBAD033的生物量呈先升高后降低的趨勢，當溫度為5 ℃、10 ℃、15 ℃和55 ℃時，菌株FSCBAD033基本不生長，菌株FSCBAD033在溫度25～40 ℃的范圍內生物量較高（OD600nm值＞1），當溫度為40 ℃時獲得最高生物量（OD600nm值=1.815）。

圖3 溫度對發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.4.3 初始pH值對菌株FSCBAD033生長的影響

由圖4可知，隨著初始pH值的升高，菌株FSCBAD033的生物量呈先升高后降低的趨勢，當初始pH值為2和3時，菌株FSCBAD033基本不生長，菌株FSCBAD033在初始pH值4～8的范圍內生物量較高（OD600nm值＞1），當初始pH值為6時獲得最高生物量（OD600nm值=1.834）。

圖4 初始pH值對發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033生長的影響Fig.4 Effect of initial pH value on the growth of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.4.4 NaCl含量對菌株FSCBAD033生長的影響

由圖5可知，隨著NaCl含量的升高，菌株FSCBAD033的生物量呈先升高后降低的趨勢，當NaCl含量＞24%時，菌株FSCBAD033基本不生長，菌株FSCBAD033在NaCl含量0～15%的范圍內生物量較高（OD600nm值＞1），低含量NaCl（＜3%）可以促進菌株FSCBAD033的生長，當NaCl含量為3%時獲得最高生物量（OD600nm值=1.892）。

圖5 NaCl含量對發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033生長的影響Fig.5 Effect of NaCl content on the growth of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5 菌株FSCBAD033的生物胺降解特性研究

2.5.1 菌株FSCBAD033脫除生物胺的作用方式

由圖6可知，未滅活菌株FSCBAD033對4種生物胺的脫除能力較強（均＞65%），滅活菌株FSCBAD033對4種生物胺的脫除能力較弱（均＜5%），說明菌株FSCBAD033脫除4種生物胺主要通過生物降解的方式，物理吸附作用不明顯。

圖6 滅活和未滅活發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033的生物胺脫除率比較Fig.6 Comparison of biogenic amines removal rates between inactivated and unactivated Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.2 菌株FSCBAD033對混合生物胺的降解動力學研究

由圖7可知，菌株FSCBAD033對酪胺的降解能力最強，3 h降解52.4%酪胺，12 h降解100%酪胺；對其他3種生物胺也表現出較強的降解能力，時間3～12 h范圍內降解率：尸胺＞腐胺＞組胺，時間15～24 h范圍內降解率：腐胺＞尸胺＞組胺，24 h腐胺、尸胺和組胺的降解率分別為83.1%、77.9%和67.8%。

圖7 發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033對四種生物胺的降解動力學曲線Fig.7 Degradation kinetics of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.3 溫度對菌株FSCBAD033降解生物胺的影響

由圖8可知，菌株FSCBAD033對4種生物胺的降解率均隨溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，菌株FSCBAD033在溫度30～40℃的范圍內對4種生物胺的降解率均超過50%，其中，酪胺降解率維持在100%，腐胺（85.7%）、尸胺（76.4%）和組胺（69.8%）最高降解率的溫度分別是35℃、37℃和37℃；當溫度為5 ℃、10 ℃、50 ℃和55 ℃時，菌株FSCBAD033未表現出明顯的生物胺降解活性。生物體一般通過胺氧化酶或胺脫氫酶實現對生物胺的分解作用，溫度可對微生物產酶和酶活性產生較大的影響，從而影響生物胺的降解[29]。

圖8 溫度對發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033降解四種生物胺的影響Fig.8 Effect of temperature on the degradation of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.4 初始pH值對菌株FSCBAD033降解生物胺的影響

由圖9可知，菌株FSCBAD033對4種生物胺的降解率均隨初始pH值的升高呈現先上升后下降的趨勢，菌株FSCBAD033在初始pH值5～7的范圍內對4種生物胺的降解率均＞50%，其中，在初始pH值4～7的范圍內可全部降解酪胺，腐胺（86.7%）、尸胺（82.4%）和組胺（78.4%）最高降解率的初始pH值分別是5、5和7；當初始pH值為2時，菌株FSCBAD033對4種生物胺均未表現出明顯的降解活性。因此，菌株FSCBAD033在初始pH值5～7的范圍內，能保持較好的生物胺降解活性。

圖9 初始pH值對發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033降解四種生物胺的影響Fig.9 Effect of initial pH on the degradation of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.5 NaCl含量對菌株FSCBAD033降解生物胺的影響

由圖10可知，菌株FSCBAD033對4種生物胺的降解率整體上隨NaCl含量的升高呈現先平穩后下降的趨勢，菌株FSCBAD033在NaCl含量＜6%的范圍內對4種生物胺的降解率均＞50%，其中，在NaCl含量不高于3%的范圍內可全部降解酪胺，當NaCl含量＞18%時，菌株FSCBAD033對4種生物胺的降解率均低于50%；當NaCl含量＞24%時，菌株FSCBAD033對4種生物胺均未表現出明顯的降解活性。因此，菌株FSCBAD033在NaCl含量＜6%的范圍內，能保持較好的生物胺降解活性。

圖10 NaCl含量對發酵檸檬乳桿菌FSCBAD033降解四種生物胺的影響Fig.10 Effect of NaCl content on the degradation of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

3 結論

本研究從發酵3個月的魚露樣品中篩選到一株高效生物胺降解乳酸菌菌株FSCBAD033，經形態學觀察、碳源利用情況分析和分子生物學鑒定，確定該菌株為發酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）。該菌株在0.05 mol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖液（含3%NaCl和腐胺、尸胺、組胺、酪胺各100 mg/L）中，37 ℃條件下靜置保持24 h后可降解86.4%腐胺、78.5%尸胺、72.3%組胺和100%酪胺，且在含有前體氨基酸的培養基中不積累上述4種生物胺。菌株FSCBAD033在溫度25～40 ℃、初始pH值4～8、NaCl含量1%～15%的范圍內生長良好，在溫度30～40 ℃、初始pH值5～7、NaCl含量＜6%的范圍內對腐胺、尸胺、組胺和酪胺的降解率均＞50%。本研究篩選到的高效生物胺降解菌菌株FSCBAD033，有潛力作為功能發酵劑用于降低食品中的生物胺含量，研究數據也為其應用對象的選擇提供重要參考。