蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物轉化和生物合成研究進展

陳文杰，胡耀廷，王如鋒,3,4*，趙淑娟,3,4*，王崢濤,3,4

1.上海中醫藥大學中藥研究所，上海 201203

2.中藥新資源與品質評價國家中醫藥管理局重點研究室，上海 201203

3.中藥標準化教育部重點實驗室，上海 201203

4.上海市中藥復方重點實驗室，上海 201203

以蟾酥為代表的蟾蜍類藥材是一類傳統動物藥[1-5]，藥用歷史悠久，市場需求量大。隨著國內外學者對蟾蜍類藥材研究的深入，發現其所含蟾蜍二烯酸內酯類成分在強心、抗腫瘤、鎮痛、抗炎、抗病毒、抗輻射、鎮咳、利尿、調節免疫等多方面具有顯著的藥理活性[1,6-8]，臨床上廣泛應用于冠心病、心臟病等相關疾病的治療[1]。例如，在麝香保心丸中，臣藥蟾酥在治療心肌缺血引起的心絞痛、胸悶、心肌梗死以及冠心病中發揮了重要的作用[9-12]。

目前，蟾蜍二烯酸內酯類成分的獲取主要從蟾酥等蟾蜍類藥材中直接提取[1,13]，該方法成本高、收益低。隨著醫藥及研發需求的日益增長，蟾蜍類藥材的開發與應用，需要充足的藥用資源作為支撐，僅僅依靠現有的天然蟾蜍資源，必然會導致蟾蜍野生物種衰退甚至滅絕，嚴重破壞生態環境平衡。通過人工規模化養殖蟾蜍，不僅需要一定的生長周期，而且還要面臨產品純化難、品種退化及重金屬污染等諸多問題[14-16]。一直以來，國內外對蟾酥的研究主要集中在化學成分和藥理作用[1,17]，而解決其藥用資源短缺難題的研究相對較少。近年來，中藥活性成分的生物合成在保護中藥資源方面發揮起越來越要的作用[18]。基于合成生物學原理，設計和改造微生物菌株生產天然產物的方法已被廣泛認可，該方法的應用需要建立在目標產物生物合成途徑完全解析的基礎之上[19-22]。本文全面總結了蟾酥中主要蟾蜍二烯酸內酯類成分及其相互間的生物轉化關系，系統回顧了蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成途徑解析進展及其生物轉化應用，并進一步討論了蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成的發展前景。

1 蟾蜍二烯酸內酯類成分結構分類

蟾蜍內酯類是珍稀中藥蟾酥的主要活性成分，為中華大蟾蜍Bufo gararizansCantor 或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider 的次生代謝產物。蟾蜍內酯類成分主要分為兩類，即蟾蜍二烯酸內酯類（bufadienolides）和20,21-環氧蟾蜍內酯類[1]。

在新鮮采集的蟾酥中，蟾蜍二烯酸內酯類成分主要為蟾蜍毒素類化合物，而蟾蜍毒素類化合物又分為蟾毒、蟾毒配基硫酸酯和蟾毒配基脂肪酸酯。而中藥制劑和臨床上使用的是加工炮制過后的蟾酥制品。鮮蟾酥經高溫炮制后，主要成分蟾蜍毒素類化合物會分解為蟾毒配基類化合物。蟾蜍二烯酸內酯類成分是一類甾體強心苷，在C-17 位與六元不飽和內酯環（α-吡喃酮環）相連。根據配體母核上的取代基的不同，蟾蜍二烯酸內酯類成分按照其配基上母核取代基的不同分為5 類，分別為蟾毒靈類（I）、脂蟾毒配基類（II）、沙蟾毒精類（III）、假蟾毒精類（IV）、環氧酯蟾毒配基類（V），母核結構見圖1[1,13,17]。蟾蜍二烯酸內酯類成分的結構特征是A/B 環順式結構、B/C 環反式結構和C/D 環反式結構，同時還具有諸如3-OH、14β-OH 或14,15-環氧環的特征取代基基團[17]。

圖1 蟾蜍二烯酸內酯類成分的結構母核Fig.1 Skeletons of bufadienolides

2 蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物轉化

目前，已分離出142 種蟾蜍內酯類化合物，如蟾毒靈（bufalin，1）、酯蟾毒配基（resibufagenin，2）、華蟾毒精（cinobufagin，3）、華蟾毒它靈（cinobufotalin，4）、遠華蟾毒精（telocinobufagin，5）等。其中蟾毒靈、酯蟾毒配基和華蟾酥毒基作為蟾酥質量標準中含量測定的指標成分被收錄于《中國藥典》2020年版。

蟾蜍二烯酸內酯類成分具有良好的強心、鎮痛、抗腫瘤、消炎等藥理活性[23-24]。游離性蟾蜍二烯酸內酯類成分水溶性較差，對人體具有一定毒性[25]。因此，許多研究者嘗試通過生物轉化改變蟾蜍二烯酸內酯類成分相關化學結構，以尋找具有良好生理活性且毒性低的結構新穎的化合物。生物轉化（biotransformation）是利用生物體系（細菌、真菌或植物組織等）或酶為催化劑對外源性化合物進行結構修飾以實現化學轉化的生物化學過程，具有選擇性強、反應條件溫和、催化效率高、反應類型多、產物成分較為單一、易于分離純化等優點，往往可用于有機合成難以完成的化學反應，易于得到結構新穎的化合物[26]。本文總結了利用微生物及植物懸浮培養體系對蟾蜍二烯酸內酯類成分進行生物轉化的研究進展，生物轉化產物見圖2。

圖2 蟾蜍二烯酸內酯類成分生物轉化反應的產物Fig.2 Biotransformation products of bufadienolides

2.1 微生物轉化

葉敏等[26-28]利用鏈格孢Alternaria alternateAS 3.457 8 對華蟾毒精（3）進行生物轉化實驗，分離并鑒定了6 個轉化產物，其中12β-羥基-去乙酰華蟾毒精（12β-hydroxy-desacetylcinobufagin，6）、3-氧代-12β-羥基-華蟾毒精（ 3-oxo-12β-hydroxy- cinobufagin，7）、3-氧代-12β-羥基-去乙酰華蟾毒精（3-oxo-12β-hydroxy-desacetylcinobufagin，8）、12-氧代-華蟾毒精（12-oxo-cinobufagin，9）和3-氧代- 12α-羥基華蟾毒精（3-oxo-12α-hydroxycinobufagin，10）為新化合物，主要的生物轉化反應為12β-羥基化、3-OH 脫氫和16-位脫乙酰基。該轉化過程的動態考察結果顯示，華蟾毒精的轉化順序為華蟾毒精先全部轉化為12β-羥基-華蟾毒精，然后發生了3-OH 脫氫反應，最后是16-位脫乙酰基反應[26]。銅綠假單孢菌Pseudomonas aeruginosaAS 1.860 對華蟾毒精（3）表現出特異性的3-OH 脫氫作用[26,29]。刺囊毛霉Mucor spinosusAS 3.3450 對蟾毒靈（1）的生物轉化反應，分離并鑒定了12 個產物，其中7β-羥基-蟾毒靈（7β-hydroxy-bufalin，11）、11β-羥基蟾毒靈（11β-hydroxybufalin，12）、16α-羥基-蟾毒靈（16α-hydroxy-bufalin，13）、7β,16α-二羥基-蟾毒靈（7β,16α-dihydroxy-bufalin，14）、1β,7β-二羥基-蟾毒靈（1β,7β-dihydroxy-bufalin，15）、1β,12β-二羥基-蟾毒靈（1β,12β-dihydroxy-bufalin，16）和3-表-7β-羥基-蟾毒靈（3-epi-7β-hydroxy-bufalin，17）為新化合物，主要的生物轉化反應為7β-、12β- 和16α-位羥基化[26,30-31]。細孢毛霉Mucor subtilissimusAS 3.2454 對酯蟾毒配基（2）的生物轉化反應，分離并鑒定了7 個轉化產物，主要的轉化反應是1β-、11β-、12β- 和16α-位羥基化，產物中包括了單羥基化、雙羥基化和糖苷化化合物[26]。絲狀真菌Mucor polymorphosporus生物轉化酯蟾毒配基（2）共獲得22 種產物，其中3-表-7β-羥基-酯蟾毒配基（3-epi- 7β-hydroxy-resibufogenin，18）、5β,7β-二羥基-酯蟾毒配基（5β,7β-dihydroxy-resibufogenin，19）、7α-羥基- 酯蟾毒配基（7α-hydroxy-resibufogenin，20）、3-表- 12β- 羥基-酯蟾毒配基（ 3-epi-12β-hydroxy- resibufogenin，21）、5β,12β-二羥基-酯蟾毒配基（5β,12β-dihydroxy-resibufogenin，22）、3-表-12α-羥基-酯蟾毒配基（3-epi-12α-hydroxy-resibufogenin，23）、5β,12α-二羥基-酯蟾毒配基（5β,12α-dihydroxy- resibufogenin，24）、1β,12α-二羥基-酯蟾毒配基（1β,12α-dihydroxy-resibufogenin，25）、3-氧代-12α-羥基-酯蟾毒配基（3-oxo-12α-hydroxy-resibufogenin，26）、12-氧代-酯蟾毒配基（12-oxo-resibufogenin，27）、3-表-16β-羥基-酯蟾毒配基（3-epi-16β-hydroxy- resibufogenin，28）、7β,16α-二羥基-酯蟾毒配基（7β, 16α-dihydroxy-resibufogenin，29）、12β,16α-二羥基-酯蟾毒配基（12β,16α-dihydroxy-resibufogenin，30）、1β,16α-二 羥 基-酯蟾毒配基（1β,16α-dihydroxy- resibufogenin，31）及12α,16α-二羥基-酯蟾毒配基（12α,16α-dihydroxy-resibufogenin，32）為新化合物[32]。轉化反應涉及1β-、C-5、7α-、7β-、12α-、12β- 和16α-位的羥基化以及3-OH 的差向異構化和脫氫化，其中12α-、12β- 和16α-位的羥基化是主要生物轉化反應[32]。銅綠假單孢菌對酯蟾毒配基（2）和12β-羥基-酯蟾毒配基（12β-hydroxy-resibufogenin，33）表現出特異性的3-OH 脫氫作用[26,29]。Fusarium solaniAS 3.1829 菌株對酯蟾毒配基（2）的生物轉化反應，分離鑒定了5 個轉化產物，其中3-(1,2-二甲基-1,2-乙二醇縮醛)-酯蟾毒配基[3-one-cyclic 3-(1,2-dimethyl-1,2-ethanediylacetal)-resibufogenin，34]、3-二甲氧基-酯蟾毒配基（3-dimethoxyl- resibufogenin，35）和3-表-15α-羥基-7βH-蟾毒靈（3-epi-15α-hydroxy-7βH-bufalin，36）為新化合物[33]。Curvularia lunataAS 3.4381 對酯蟾毒配基（2）的生物轉化反應，分離并鑒定了4 個轉化產物，其中12-氧代-3-表-16β-羥基-酯蟾毒配基（12-oxo-3-epi-16β- hydroxy-resibufogenin，37）和12β,15-環氧-3-表-蟾毒 靈-14,15-烯（12β,15-epoxy-3-epi-bufalin-14,15- ene，38）為新化合物，觀察到在生物轉化反應過程中存在異構化、羥基化和氧化反應[34]。由Actinomucor elegansAS 3.277 8 對酯蟾毒配基（2）進行生物轉化反應，分離并鑒定了5 種產物，反應中觀察到了高度立體和區域特異性異構化、羥基化和酯化反應，產物中3-表-12-氧代-羥基酯蟾毒配基（3-epi-12-oxo-hydroxy-resibufogenin，39）和3α-乙酰氧基-15α-羥基蟾毒靈（3α-acetyloxy-15α-hydroxy- bufalin，40）未見報道[35]。鏈格孢對蟾毒它靈（bufotalin，41）的生物轉化反應，分離并鑒定了3種轉化產物，其中12β-羥基-蟾毒它靈（12β-hydroxy- bufotalin，42）和 3-氧代-12β-羥基-蟾毒它靈（3-oxo-12β-hydroxy-bufotalin，43）為新化合物[36]。鏈格孢對沙蟾毒精（arenobufagin，44）轉化得到3個轉化產物，其中 3-氧代-沙蟾毒精（3-oxo- arenobufagin，45）、3-氧代-異沙蟾毒精（3-oxo- bufarenogin，46）為新化合物[37]。鏈格孢對華蟾毒它靈（4）的生物轉化反應得到了4 個轉化產物，其中12β-羥基-華蟾毒它靈（12β-hydroxy-cinobufotalin，47）新化合物[37]。革蘭陽性菌芽孢桿菌Bacillussp.CMB-TD29 能特異性羥基化南美蟾毒精（marinobufagenin，66），生物轉化反應產生了11α-、12β-、17-α 3 種新的羥基化衍生物[38]。

2.2 植物懸浮培養細胞生物轉化

長春花Catharanthus roseus(L.) G.Don.細胞培養體系對華蟾毒精（3）的生物轉化反應獲得了8個轉化產物，其中5 個為新化合物，分別為1β-羥基- 去乙酰華蟾毒精（ 1β-hydroxy-desacetyl- cinobufagin，48）、華蟾毒精 3-O-β-D-葡萄糖苷（cinobufagin-3-O-β-D-glucoside，49）、3-氧代-去乙酰華蟾毒精-16-O-β-D-葡萄糖苷（3-oxo-desacetyl- cinobufagin-16-O-β-D- glucoside，50）、去乙酰華蟾毒精-16-O-β-D-葡萄糖苷（desacetyl-cinobufagin- 16-O-β-D-glucoside，51）和3-表-去乙酰華蟾毒精- 16-O-β-D-葡萄糖苷（3-epi-hydroxy-desacetylcinobufagin- 16-O-β-D-glucoside，52）[26,39-40]。長春花細胞培養體系能使華蟾毒精（3）的3-OH 和16-OH 發生糖基化反應，證明長春花細胞培養體系能特異性糖苷化華蟾毒精，其他轉化反應還包括C-5、C-1β位羥基化，3-OH 脫氫反應及C-16 位脫乙酰基反應等[26,39-40]。桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.) A.DC.細胞懸浮培養體系對華蟾毒精（3）的生物轉化反應得到了3 個產物，其中去乙酰華蟾毒它靈（desacetylcinobufotalin，53）為主產物[26,39]。長春花和桔梗體系對華蟾毒精（3）的生物轉化具有一定的相似性，轉化反應以C-5 位羥基化和C-16 位脫乙酰基為主[26,39-40]。桔梗懸浮培養體系對蟾毒靈（1）的生物轉化反應得到2 個產物，分別為3-表-遠華蟾毒精（3-epi-telocinobufagin，54）和3-表-蟾蜍靈-3-O-β-D-葡萄糖苷（3-epi-bufalin-3-O-β-D-glucoside，55）[41]。銀杏Ginkgo bilobaL.葉細胞懸浮培養體系生物轉化酯蟾毒配基（2），轉化產物為3-表-酯蟾毒配基（3-epi-resibufogenin，56）[42]。李莉欣[43]研究結果顯示，桔梗懸浮培養體系對酯蟾毒配基（2）的生物轉化反應得到了4 個產物，其中1β-羥基-酯蟾毒配基（1β-hydroxy-resibufogenin，57）和3-表-南美蟾毒精（3-epi-marinobufagenin，58）為新化合物。雪蓮Saussurea involucrate(Kar.et Kir.) Sch.-Bip.懸浮細胞對蟾毒它靈（41）有較好的生物轉化能力，從中分離并鑒定了5 個轉化產物，其中3-表-蟾毒它靈（3-epi-bufotalin，59）、3-表-去乙酰蟾毒它靈（3-epi-desacetylbufotalin，60）、3-表-蟾毒它靈-3-O-β-D-葡萄糖苷（3-epi-bufotalin-3-O-β-D-glucoside，61）和1β-羥基蟾毒它靈（1β-hydroxy-bufotalin，62）為新化合物[37]。雪蓮懸浮細胞體系對遠華蟾毒精（5）的生物轉化反應，分離并鑒定了4 個轉化產物，但是轉化率較低，可能遠華蟾毒精水溶性較差以致反應不完全[37]。雪蓮懸浮細胞對日蟾毒它靈（gamabufotalin，63）的生物轉化反應，分離并鑒定了 4 個轉化產物，其中 3-表-日蟾毒它靈（3-epi-gamabufotalin，64）和3-氧代-Δ1-日蟾毒它靈（3-oxo-Δ1-gamabufotalin，65）為新化合物[37]。

3 蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成

3.1 蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成途徑解析進展

蟾蜍二烯酸內酯類成分為乙型強心苷，強心甾類成分為甲型強心苷，它們的區別為強心苷元C-17位上的不飽和內酯環。蟾蜍二烯酸內酯類成分為六元不飽和內酯環，強心甾類成分為五元不飽和內酯環。蟾蜍二烯酸內酯類化合物在植物和動物體內均有，動物中主要存在于蟾蜍毒腺內。植物體內的蟾蜍二烯酸內酯類化合物生物合成途徑與蟾蜍體內的并不一致，前者更接近與強心甾的生物合成途徑。與蟾蜍二烯酸內酯類不同，強心甾類成分大多存在于在植物體內，如洋地黃類植物。

在洋地黃植物中，強心甾類成分的生物合成途徑：甲羥戊酸→膽固醇→孕烯醇酮→孕酮→強心甾類[44-48]（圖3）。可以為動植物中蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成途徑解析提供一些借鑒。類似的，膽固醇也是植物來源蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成前體[49]。后續其反應過程大致如下：首先是膽固醇的側鏈發生斷裂，依次在C-22 位和C-20 位發生羥基化反應，隨后C-20/22 鍵斷裂生成孕烯醇酮，孕烯醇酮氧化生成孕酮，孕酮還原得到3β-羥基- 5β-20-孕酮，最后發生14β-羥基化反應[50-52]。對于六元不飽和內酯環的形成過程，首先側鏈C-21 位發生羥基化反應，形成草二酰酯中間體，通過如圖3所示的羥醛加成過程和脫羧反應，生成含有六元不飽和內酯環的蟾蜍二烯酸內酯類成分[50-52]。

在蟾蜍中，Siperstein 等[53]利用同位素示蹤法揭示marinobufotxin 和南美蟾毒精的生物合成前體為膽固醇。膽固醇在動物中被代謝成孕烯醇酮和羥基膽汁酸鹽，這可能是蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成的重要中間體。Chen 等[54]通過給予蟾蜍14C或氘標記的類固醇，發現5α-和3β,5β-羥基膽酸鹽衍生物是比膽固醇更有效的前體；但是給予標記的孕烯醇酮時不能檢測到放射性。這與已報道的植物中強心甾類生物合成前體是孕烯醇酮的結果正好相反[54]。

為了找到動植物來源蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成途徑之間的相關性，Porto 等[49]同時給蟾蜍和紅海蔥Scilla marilima(L.) Stearn 接種孕烯醇酮- 20-14C，結果發現孕烯醇酮是scilliroside 的良好前體，但是它沒有被合成到南美蟾毒精。該實驗表明Chen 等[54]實驗結果可能是正確的，即在蟾蜍體內，膽固醇被代謝為孕烯醇酮的情況下，后者不能用來合成蟾蜍二烯內酯類成分。進一步，Porto 等[55]和Dmitrieva 等[56]研究結果證實了蟾蜍二烯酸內酯類的生物合成不依賴于膽固醇側鏈的切割。膽固醇可能先轉化為膽汁酸鹽中間體，后者可以通過其他步驟轉化為蟾蜍二烯內酯類成分。從蟾蜍毒液中分離出來的7α-羥基膽固醇和7β-羥基膽固醇（膽汁酸生物合成中的關鍵中間體）將支持這一假設[49]。另外，Fedorova等[57-58]發現哺乳動物的marinobufagenin是由膽固醇通過新型酸性膽汁酸途徑合成的，而marinobufageni 與南美蟾毒精具有相似的化學結構。在新型酸性膽汁酸途徑中，膽固醇側鏈的切割由細胞色素P450（CYP）27A1 酶啟動，該酶在肝外組織中表達，包括腎上腺[58-62]。因此，蟾蜍可能通過 一種類似于哺乳動物中marinobufagenin 的肝外酸性膽汁酸途徑合成蟾蜍二烯酸內酯類成分。

圖3 蟾蜍二烯酸內酯類成分的下游生物合成途徑 (植物)[50-52]Fig.3 Downstream biosynthetic pathways of bufadienolides (plant)[50-52]

孕烯醇酮在強心甾類及其相關化合物的生物合成中起著非常重要的作用[49]。Garraffo 等[63]研究結果顯示，具有完整的膽固醇型側鏈的膽固醇及其類固醇能夠穿透到蟾蜍二烯內酯類成分生物合成的位點并且通過未知機制轉化為蟾蜍二烯酸內酯類成分。孕烯醇酮在蟾蜍中作為蟾蜍烯二烯內酯類成分前體的失敗原因可能是由于其不能滲透到蟾蜍烯二烯內酯類成分的生物合成位點[63]。Santa Coloma 等[64]將乙酸鈉-1-14C和甲羥戊酸-5-3H接種到蟾蜍的耳后腺和肝臟，發現肝臟產生的膽固醇中含有這樣2 種標記，而耳后腺產生的膽固醇不含任何標記。推測蟾蜍中用于合成的膽固醇前體主要在肝臟或腸道產生，并通過轉運蛋白轉移到皮膚腺和耳后腺從而發揮前體的作用。

3.2 蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成途徑總結與推測

如圖4 所示，推測蟾蜍中蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成可能分為3 個階段。第1 階段是類異戊二烯前體和膽固醇中間體的形成。無論是在植物中還是在蟾蜍中，蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成起點都是類異戊二烯前體[56]。類異戊二烯前體經過甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4- phosphate，MEP/DOXP）途徑生成異戊焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimenthylallylpyrophosphate，DMAPP）[65]。IPP 和DMAPP 經過一系列酶的作用下，生成香葉草基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP）和焦磷酸法尼酯（farnesyl pyrophosphate，FPP）[65]。兩分子FPP 在鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）的作用下合成角鯊烯（squalene）。角鯊烯為甾體化合物的前體。下一步，角鯊烯在鯊烯環氧酶（squalene epoxidase，SQE）的作用下，生成中間體2,3-氧化角鯊烯（2,3-oxiaosqualene）[65]。該中間體可啟動角鯊烯的環化反應，即在2,3-氧化角鯊烯在羊毛甾醇合酶（lanosterol synthase，LS）的作用下環化成羊毛甾醇（lanosterol），其主要作用是合成甾體骨架[65-66]。最后，羊毛甾醇經過一系列酶的作用下合成酵母甾醇（zymosterol）和膽固醇[65]。

蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成第2 階段涉及膽固醇甾體母核A/B 環的脫氫異構化、母核14β-OH 或14,15-環氧化以及膽固醇側鏈的修飾環合。對于這一階段的反應機制、反應順序以及相關酶基因的研究報道很少（圖3）。第2 階段中，蟾蜍二烯酸內酯類成分的母核A/B 環發生一系列氧化、脫氫、異構化和還原過程，并且3-羥基-5-烯結構轉化為3-羥基-5-βH結構形成順式配置的A/B 環[67]。3β-HSD 屬于短鏈脫氫酶/還原酶超家族[68]。其催化甾體的Δ5-3-羥基構型氧化轉化為Δ4-3-羰基構型。該轉化反應是在2 個獨立的順序反應中進行的，在需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的第1 個反應中，該酶催化3β-羥基類固醇脫氫為3-氧代類固醇中間體；在第2 個反應中，還原的輔酶（仍保持附著在酶上）激活還原反應，使Δ5構型異構化為Δ4構型[67-68]。這些結果表明3β-HSD 可能在蟾蜍二烯酸內酯類成分A/B 環順式構型的形成中發揮重要作用。相關研究表明[69-70]，3β-HSD 可以催化膽固醇轉化為4-cholesten-3-one，后者可以先后7α-羥基化為4-cholesten-7α-ol-3-one，這是重要的膽汁酸生物合成中間體。而膽汁酸可能是蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成的最重要的中間體之一[56,71]。Xu 等[67]從中華大蟾蜍中克隆了一個Bbg-3βHSD 脫氫酶，發現其能氧化孕烯醇酮和脫氫表雄酮，但卻對膽固醇和谷固醇沒有脫氫活性；原因可能是Bbg-3βHSD 脫氫酶的催化口袋無法容納C27類固醇的長側鏈。3β-HSD7 脫氫酶對具有Δ5-雙鍵的3β,7β-二羥基-C27-類固醇具有高度特異性[72-73]。所以，膽固醇可能先經過CYP27A1 啟動的酸性膽汁酸途徑形成27-羥基膽固醇和3β-羥基-5-膽甾烯酸酯，然后膽汁酸鹽被3β-HSD7 催化形成順式配置的A/B 環[71]。

蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成的第3 階段是相關基因家族對母核上多種取代基的修飾（圖4）。這也是蟾蜍二烯酸內酯類成分化學結構多樣性的原因。由于絕大多數的蟾蜍二烯酸內酯類成分母核結構為蟾毒靈類（I）和酯蟾毒配基類（II）。所以本文總結了這2 類母核結構的蟾蜍二烯酸內酯類成分，并根據母核上取代基的類型、數量和位置，推斷它們相互間結構的生物轉化關系和繪制了可能轉化路線圖（圖5）。總結發現，蟾蜍二烯酸內酯類成分化學結構差異的原因主要是取代基的類型、數量、位置和立體異構。蟾蜍二烯酸內酯類成分的甾體母核上具有多種取代基，如羥基、環氧基、乙酰基、糖基、酮基等。因此，參與蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成有關的基因家族可能包括CYP450s、糖基轉移酶[74]（glycosyltransferases，UGTs）、酰基轉移酶（acyltransferases，ATs）和脫氫酶（dehydrogenases，DHs）等。涉及的羥基化反應主要位于C-1β、3β、5β、11α、12α/β、14β、16β 和19 位；乙酰化和糖基化反應主要位于C-3β、16β 位；氧代反應主要位于在C-3、11、12 和19 位。

圖4 蟾蜍二烯酸內酯類成分可能的生物合成途徑 (蟾蜍)Fig.4 Possible biosynthetic pathways of bufadienolides (B.gararizans)

圖5 蟾蜍二烯內酯類成分的生物轉化路線圖Fig.5 Roadmap of bufadienolides biotransformation

5β-OH、14β-OH 和14,15-環氧化的先后順序：首先，14β-OH 和14,15-環氧化是蟾蜍二烯酸內酯類成分的特征基團，目前從自然界分離并鑒定的蟾蜍二烯酸內酯類成分都含有14β-OH 或者14,15-環氧化。其次，由于在C-5 沒有羥基的蟾蜍二烯酸內酯類已經存在，所以14β-OH 或14,15-環氧化應該在5β-OH 之前[54]。而對于蟾蜍二烯內酯類成分中α- 吡喃酮環的生物合成，Porto 等[75]結果顯示，蟾蜍中蟾蜍二烯酸內酯類成分的α-吡喃酮環可能直接來源于膽固醇的側鏈。另外，內酯環應該是在內核氧化之后產生的[54]。最后，Chen 等[54]討論了不同蟾蜍二烯酸內酯類成分之間生物合成的可能順序，其推測酯蟾毒配基首先通過還原為蟾毒靈或進一步羥基化成為南美蟾毒精，接著通過相似的還原或羥基化反應，南美蟾毒精和蟾毒靈分別被代謝為遠華蟾毒精。

4 總結與展望

目前，蟾酥藥用資源需求量與日俱增，使得蟾蜍二烯酸內酯類成分成為研究熱點。除了人工養殖蟾蜍以外，獲取蟾蜍二烯酸內酯類成分的途徑還包括生物轉化和生物合成等。生物轉化在獲取天然蟾蜍類藥材中不存在的蟾蜍二烯酸內酯類成分方面具有較為突出的優勢。基于合成生物學原理，設計和改造微生物菌株來發酵生產天然產物，是一種極具潛力的稀有天然活性成分獲取辦法。迄今為止，蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成途徑的解析已獲得較大的進展。本文總結蟾蜍體內可能的蟾蜍二烯酸內酯類成分生物合成途徑。推測蟾蜍中蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成可能分為3 個階段，首先是類異戊二烯前體和膽固醇中間體的形成；然后是膽固醇或膽汁酸鹽甾體母核A/B 環的脫氫異構化、母核14β-OH 或14,15-環氧化以及膽固醇側鏈修飾環合；最后是蟾蜍二烯酸內酯類母核上取代基的修飾，其涉及的基因家族可能包括CYP450s、UGTs、ATs 等。現階段，蟾蜍二烯酸內酯類生物合成第2、3 階段的反應機制、反應順序以及相關酶基因發現的研究報道很少。隨著高通量測序及組學技術發展，未來應該多學科聯系攻關以推進蟾蜍二烯酸內酯類成分的合成生物學發展，革新傳統的生產方式，使蟾蜍二烯酸內酯類成分的生物合成成為蟾酥藥用資源可持續利用的重要途徑之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突