冬蟲夏草中砷及其安全性評價研究進展

肖遠燦，李 岑，楊紅霞，杜玉枝，張 明，畢宏濤，魏立新*

1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評價研究重點實驗室，青海 西寧 810008

2.中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810008

3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 101408

冬蟲夏草是我國名貴中藥材，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.寄生于蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲形成的蟲菌復(fù)合物[1]，自然分布于我國青海、西藏、四川、甘肅和云南等地區(qū)，生長在海拔3000 m 以上的高寒草地、高山草甸和高山灌叢[2]。冬蟲夏草味甘，性平，歸肺、腎經(jīng)，具有補腎益肺、止血化痰的功效[1]，還具調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]、抗疲勞[5]、治療2 型糖尿病[6]等眾多的藥理活性。

冬蟲夏草中砷超標及其安全性問題由來已久[7]，2016年2月4日國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布“關(guān)于冬蟲夏草的消費提示”，提示消費者“冬蟲夏草、冬蟲夏草粉及純粉片產(chǎn)品中，砷含量為4.4～9.9 mg/kg”“長期食用冬蟲夏草、冬蟲夏草粉及純粉片等產(chǎn)品會造成砷過量攝入，并可能在人體內(nèi)蓄積，存在較高風(fēng)險”[8]。

砷是一種廣泛存在于自然界的類金屬元素[9]，其毒性依賴于其存在的化學(xué)形態(tài)，無機砷具有較高毒性，被列入I類致癌物質(zhì)中，有機砷毒性較小或沒有毒性[10]。此外，含砷物質(zhì)的毒性還受到生物可給性和生物利用度的制約[11]。本文對近年來冬蟲夏草中砷及其安全性的研究進展進行歸納總結(jié)，從保障人民群眾用藥安全和增加對冬蟲夏草中砷認知的角度對冬蟲夏草中砷的研究進行展望，以期為冬蟲夏草的安全性評價及合理用藥研究提供參考。

1 冬蟲夏草中的總砷

1.1 總砷的分析方法

1.1.1 樣品消解方法 微波消解[7,12-38]和濕法消解[12,39-41]是冬蟲夏草樣品消解的2 種主要方式。微波消解均采用以硝酸和硝酸為主的混合酸體系及程序升溫的方法，濕法消解都采用了混合酸溶液。硝酸為冬蟲夏草樣品消解的主要消解溶劑，用量5～20 mL；以硝酸為主的混合酸包括硝酸與過氧化氫、鹽酸、高氯酸等。冬蟲夏草總砷測定的樣品用量0.05～1.0 g，且多為0.2～0.5 g。

1.1.2 儀器分析方法 冬蟲夏草總砷含量分析的儀器方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法、原子熒光光譜（AFS）法、石墨爐原子吸收（GFAAS）法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-AES）法。ICP-MS 法以其定性準確，靈敏度高，檢出限低，樣品用量少等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用，成為冬蟲夏草中砷含量分析的主流方法。AFS 法、GFAAS 法和ICPAES 法在冬蟲夏草中總砷的分析中應(yīng)用相對較少。冬蟲夏草中總砷含量測定的檢出限、定量限、加樣回收率等方法學(xué)數(shù)據(jù)見表1。

表1 冬蟲夏草中總砷測定的方法學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Methodology data of total arsenic determination of Cordyceps sinensis

1.2 冬蟲夏草中總砷含量

文獻報道了307 批次西藏、青海、四川、甘肅、云南等地產(chǎn)野生冬蟲夏草樣品中總砷含量的分析結(jié)果，質(zhì)量分數(shù)為0.052～24 mg/kg，僅有7 批次[7,20,27,39-40]質(zhì)量分數(shù)低于2 mg/kg，最高24 mg/kg 的樣品采自西藏比如縣[21]。20 批次[21,29,37]人工繁育冬蟲夏草中總砷含量均低于2 mg/kg，其中鮮樣中總砷0.07～0.13 mg/kg[29]，干品中總砷0.223～0.5 mg/kg[21,37]。砷在野生冬蟲夏草中的含量：蟲體＞子實體，子實體中的總砷均低于2 mg/kg，且蟲體總砷是子實體的7～13 倍[25,34]，見表2?？傮w上看，野生冬蟲夏草中總砷含量均較高，而人工繁育冬蟲夏草中總砷均能滿足《中國藥典》2020年版對植物藥的限量要求。

表2 不同產(chǎn)地冬蟲夏草中總砷含量Table 2 Content of total arsenic in C.sinensis from different origins

2 冬蟲夏草中的砷形態(tài)

砷對生物體的毒性與其化學(xué)形態(tài)密切關(guān)聯(lián)，亞砷酸根（iAsⅢ）和砷酸根（iAsV）對人體細胞的半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）分別為5.49、571 μmol/L，而砷糖、砷脂等有機砷的LD50值遠大于iAsⅢ和iAsV，為低毒或無毒[10]。因此，僅以總砷含量來判斷冬蟲夏草的安全性較為片面，采用砷形態(tài)分析結(jié)果能夠更為準確地評價其安全性。

2.1 常見砷形態(tài)的分析

2.1.1 常見砷形態(tài)的分析方法 高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ICP-MS）法、離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（IC-ICP-MS）法和高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用（HPLC-HG-AFS）法是目前用于冬蟲夏草中砷形態(tài)分析的3 種主要方法，其中又以HPLC-ICP-MS 法在冬蟲夏草砷形態(tài)分析中應(yīng)用最多。已報道的冬蟲夏草中常見砷形態(tài)分析的成分有iAsⅢ、iAsV、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷膽堿（AsC）和砷甜菜堿（AsB）。

（1）提取及樣品溶液制備：提取是冬蟲夏草中砷形態(tài)分析至關(guān)重要的步驟，有效、真實地提取樣品中的砷形態(tài)成分并保持其在檢測前的穩(wěn)定為準確獲取冬蟲夏草中的砷形態(tài)數(shù)據(jù)提供了必要前提。冬蟲夏草中砷形態(tài)分析采用的提取溶劑及溶液制備方法見表3。

表3 冬蟲夏草砷形態(tài)分析中的樣品溶液制備Table 3 Sample solution preparation for arsenic speciation analysis of C.sinensis

（2）分離及檢測：冬蟲夏草中砷形態(tài)的分離采用了陰離子交換色譜柱，使用的色譜柱、流動相體系、體積流量、柱溫、進樣量和分離組分的檢測方式等分析條件以及方法學(xué)數(shù)據(jù)見表4。

表4 冬蟲夏草中砷形態(tài)的分離條件及檢測方法學(xué)數(shù)據(jù)Table 4 Separation conditions and determination method data of arsenic speciation in C.sinensis

2.1.2 冬蟲夏草中常見砷形態(tài)分析結(jié)果 冬蟲夏草中砷形態(tài)分析報道較少，且報道中得出的冬蟲夏草中砷形態(tài)的種類和含量差異很大，見表5。文獻報道了來源于西藏、青海、四川和云南等地89 批次野生冬蟲夏草和東陽光公司15 批次人工繁育冬蟲夏草中砷形態(tài)的分析結(jié)果。結(jié)果顯示，冬蟲夏草中均檢出了iAsⅢ，大都檢出了iAsV，少數(shù)樣品檢出了MMA、DMA 和AsB。采用1.4 mol/L 硝酸溶液70 ℃微波對冬蟲夏草中砷有最高的提取率，達（99.85±0.007）%（n＝34）[36]，純水超聲對砷形態(tài)的提取率最低，僅為0.14%～1.48%（n＝32）[31]。2%、0.15 mol/L 稀硝酸對野生冬蟲夏草中無機砷的提取率不高于8.69%[34-35]，對人工繁育冬蟲夏草的提取率分別高達87.0%～104.2%[37]和85.5%[42]。人工胃液提取出的無機砷占冬蟲夏草總砷的6.80%～16.83%[23]和2.33%[34]。2%稀硝酸對野生冬蟲夏草子實體和蟲體中無機砷的提取率分別為34.20%、6.45%[34]。

表5 不同來源冬蟲夏草中砷形態(tài)分析結(jié)果Table 5 Arsenic speciation analysis results of C.sinensis from different origins

2.2 冬蟲夏草中砷的溶出形態(tài)

砷的溶出及溶出砷形態(tài)研究對增加冬蟲夏草中砷的認知具有積極意義。陳煒等[32]采用Tessier 連續(xù)提取法對冬蟲夏草中砷的溶出形態(tài)進行了研究。Tessier 連續(xù)提取法將重金屬形態(tài)分為水溶態(tài)和交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)、有機結(jié)合態(tài)和殘渣態(tài)等5 態(tài)，已被廣泛應(yīng)用于土壤和沉積物重金屬形態(tài)的分析中[33]。該研究采用80%乙醇、去離子水、1.0 mol/L 氯化鈉溶液、2.0%醋酸和0.6 mol/L 鹽酸對青海冬蟲夏草粉末進行了依次連續(xù)提取。結(jié)果表明，冬蟲夏草大部分的砷（2.187 5±0.039 7 μg/g，占總砷的42.37%）在殘渣中，去離子水、80%乙醇、1.0 mol/L 氯化鈉、2.0%醋酸和0.6 mol/L 鹽酸溶液提取物中砷在總砷中的占比分別為 28.43%、13.32%、13.34%、2.38%、0.15%。

2.3 冬蟲夏草中的未知結(jié)構(gòu)砷形態(tài)

未知結(jié)構(gòu)砷形態(tài)的發(fā)現(xiàn)是近幾年來冬蟲夏草砷研究的重要成果，為冬蟲夏草砷的深入研究提供了參考。對于野生冬蟲夏草中存在未知結(jié)構(gòu)砷的推斷金鵬飛等[17]、曹曉鋼等[31]、Zhou 等[34]、Guo 等[35]和邵勁松等[44]均有報道，但對未知砷的深入研究極少。

Li 等[38]以陰離子交換色譜柱和分子排阻色譜柱為分離手段，采用ICP-MS 和HPLC-ICP-MS 技術(shù)，結(jié)合模擬胃液提取、不同比例硝酸溶液提取和純水、5% NaCl 溶液、0.08 mol/L NaOH 溶液、70%乙醇溶液依次提取方法對野生冬蟲夏草中砷的溶出、砷形態(tài)在提取過程中的轉(zhuǎn)化、砷在化學(xué)成分中的分布等進行了研究。結(jié)果表明，模擬胃液溶出砷占總砷的52%，其中無機砷僅占總砷的約4%；陰離子色譜-HPLC-ICP-MS 法僅能檢出溶出砷中8%的游離無機砷；分子排阻-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（SEC-HPLC-ICP-MS）法圖譜顯示有含量較高的未知砷存在。砷在冬蟲夏草堿性蛋白中含量最高，在脂溶性成分、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和多糖中均有分布。

3 冬蟲夏草砷的安全性評價

3.1 安全性分析方法

冬蟲夏草砷的安全性是近幾年人們關(guān)注的焦點，通過現(xiàn)有方法評價冬蟲夏草砷的安全性能夠提供冬蟲夏草初步的安全性數(shù)據(jù)。目前，對冬蟲夏草中砷進行健康風(fēng)險評價的研究[24,34-36,38]均采用了美國國家環(huán)境保護局（U.S.Environmental Protection Agency，US EPA）長期暴露的非致癌風(fēng)險模型和致癌模型[45]。非致癌風(fēng)險評價模型采用靶標危害系數(shù)（target hazard quotients，THQ）對污染物長期健康風(fēng)險進行評價，而致癌風(fēng)險評價是在其基礎(chǔ)上引入了致癌斜率系數(shù)，模型的計算式如下。

計算公式中，EDI 為砷的平均每日攝入量[mg/(kg·d)]；C為冬蟲夏草中砷的濃度（mg/kg）；FIR 為每日冬蟲夏草攝入量[g/(person·d)]；EF 為暴露頻率（d/a）；ED 為暴露年限（a）；BW 為平均體質(zhì)量（kg）；TA 為暴露時間（d）；1000 為計量單位（g 到kg）換算系數(shù)；THQ 為靶標危害系數(shù)；RFD為砷的每日允許最大攝入量[mg/(kg·d)]；R 為終身致癌風(fēng)險；SF 為致癌斜率系數(shù)。當(dāng)THQ≤1 時被認為對人體健康的影響不明顯；世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）對R 的建議值為1×10?5；RFD 和SF 的取值來源于US EPA 或WHO[46-50]。

3.2 基于砷的安全性評價

文獻中基于各自對冬蟲夏草中總砷、生物可給性砷、無機砷等含量的實驗分析結(jié)果和ED、EF、BW、TA 等參數(shù)的不同設(shè)定，對冬蟲夏草砷的安全性進行了評價，得出了不同的結(jié)果，見表6。

表6 冬蟲夏草中砷的健康風(fēng)險評價Table 6 Health risk evaluation of arsenic in C.sinensis

文獻中對EF、ED 的設(shè)定值和獲得的冬蟲夏草中總砷含量的差別是造成健康風(fēng)險評價結(jié)果差異的主要原因。

盧恒等[24]分析了北京市售15 批冬蟲夏草樣品中總砷含量，均值4.032 mg/kg，計算得到致癌風(fēng)險R 為6.39×10?5，高于WHO 建議的1×10?5；在引入曹曉鋼等[31]得出的冬蟲夏草中無機砷占總砷的平均比例0.485%后，將R 值校正為3.09×10?7，并以此為依據(jù)認為冬蟲夏草中的砷不具有致癌風(fēng)險。Zhou 等[34]對產(chǎn)自青海的3 個野生冬蟲夏草樣品進行了總砷和生物可利用砷（人工胃腸液提?。┓治觯@得生物可利用砷占總砷的64.46%，生物靶標危害系數(shù)（BTHQ）為0.533 4，在設(shè)定的前提下沒有明顯健康風(fēng)險。

Guo 等[35]將分別產(chǎn)自那曲、理塘和玉樹的12 個冬蟲夏草樣品進行了總砷和砷形態(tài)分析，分別從總砷、無機砷、無機砷＋未知砷等不同角度計算了長期食用風(fēng)險；結(jié)果表明將未知砷設(shè)定為無毒和僅以無機砷計算時，冬蟲夏草砷沒有長期健康風(fēng)險。Zuo等[36]采用34 個來自西藏、青海、甘肅和云南的冬蟲夏草樣品中總砷和無機砷檢測數(shù)據(jù)對中國男性和女性冬蟲夏草砷長期暴露風(fēng)險進行了評價，結(jié)果表明當(dāng)每年暴露頻率小于2 個月時，冬蟲夏草砷對人健康風(fēng)險較小。

Li 等[38]以17 批次來自西藏、青海、甘肅和云南的冬蟲夏草中總砷、無機砷和生物可給性砷的分析結(jié)果為基礎(chǔ)進行了健康風(fēng)險評價，得出了冬蟲夏草砷的健康安全性不容忽視的結(jié)論。

4 冬蟲夏草中砷含量的限量標準

安全有效和質(zhì)量可控是藥品的基本屬性，也是保障人民群眾用藥安全的必然要求，對藥品中重金屬和有害元素進行限量是確保用藥安全的有效手段之一。然而，目前對于冬蟲夏草藥材中砷的限量標準并不十分明確。

4.1 限量標準的來源

文獻在判別冬蟲夏草中總砷含量是否超標時引用的標準包括2001年《藥用植物及制劑進口綠色行業(yè)標準》[51]，《中國藥典》2005年版[52]、2010年版[53]和2015年版[1]，《食品安全國家標準 保健食品》[54]，2015年由中國制定的《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》國際標準[55]和《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[56]等。

4.2 相關(guān)標準的解讀

《藥用植物及制劑進口綠色行業(yè)標準》[51]中對植物藥材及制劑的總砷限量為2 mg/kg。自1965年版收載冬蟲夏草以來，歷版《中國藥典》[1,52-53,57]均未對冬蟲夏草中砷的殘留量進行限定。《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》國際標準[55]中根據(jù)我國中藥材重金屬的具體情況，制定的中藥材中總砷限量值為4 mg/kg?！妒称钒踩珖覙藴?保健食品》[54]將保健食品中總砷的限量標準值定為1 mg/kg?！妒称钒踩珖覙藴?食品中污染物限量》[56]按照食品的不同種類對總砷的限量值為0.1～0.5 mg/kg。

4.3 砷限量標準的適用性分析

通過對上述冬蟲夏草研究報道中引用的砷限量標準的解讀，作為中藥材，文獻報道的某些冬蟲夏草樣品中總砷的含量超過了國際標準[55]4 mg/kg 的限量。在沒有明確的砷限量標準的情況下，為最大限度地保障人民群眾的用藥安全和食品安全，參考如《藥用植物及制劑進口綠色行業(yè)標準》[51]、《中國藥典》[1,52-53]植物類藥材砷的限量標準，以及現(xiàn)行的食品和保健食品安全標準（雖然冬蟲夏草從2010年以來已經(jīng)被明令禁止作為食品和食品原料[58]，但在民間冬蟲夏草仍然常作為食療保健品使用）來評價冬蟲夏草中砷的超標情況具有一定的合理性和可操作性。同時，目前冬蟲夏草中砷沒有明確限量的情況也提示從保障人民群眾用藥安全和食品安全角度，對冬蟲夏草中砷開展深入的研究十分必要。

5 冬蟲夏草中砷研究存在的問題

冬蟲夏草中砷的基礎(chǔ)研究薄弱。已有的研究報道大多數(shù)以測定冬蟲夏草的總砷含量為主要內(nèi)容，少數(shù)的研究涉及砷形態(tài)和生物可給性的探討，研究中僅能推斷冬蟲夏草中含有大量的結(jié)合態(tài)未知砷[38]。由于冬蟲夏草藥材本身價格昂貴，研究成本高，其深入研究極少。

針對冬蟲夏草中砷的研究方法有待建立?，F(xiàn)階段對冬蟲夏草中砷形態(tài)分析的方法多借鑒采用食品砷形態(tài)分析的分析方法[59]，且不同的研究者采用的提取溶劑體系差異較大，提取溫度和提取時間又各不相同，造成結(jié)果的較大差別，數(shù)據(jù)可比性差。

冬蟲夏草中砷的安全性評價均采用了US EPA的長期健康風(fēng)險評價和致癌風(fēng)險評價方法，這些方法基于總砷含量，且其模型主要針對環(huán)境中的無機砷，是否適合作為含有含量較高未知砷的中藥材的安全性評價模型值得探討[45]。

6 結(jié)語與展望

近年來對冬蟲夏草中砷的研究逐漸增多，并不斷深入，不同產(chǎn)地冬蟲夏草中總砷和砷形態(tài)分析數(shù)據(jù)不斷積累，冬蟲夏草中砷的暴露分析和基于總砷含量的安全性評價也陸續(xù)開展，采用污染物和致癌物評價模型初步獲取了冬蟲夏草砷的安全性評價數(shù)據(jù)，推斷并間接驗證了未知結(jié)構(gòu)砷形態(tài)的存在。然而，對冬蟲夏草中砷的認知還很有限，冬蟲夏草中砷存在形態(tài)的精準分析方法有待建立和完善，未知結(jié)構(gòu)砷需要引入先進技術(shù)探索解析，基于砷形態(tài)成分代謝的毒理學(xué)機制仍需繼續(xù)深入研究，針對冬蟲夏草自身特征、用藥特點的安全性評價模型也有待研究和建立。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突