藥用植物質量標志物多糖生物合成通路及關鍵酶研究進展

李曉崗，張 雪，俞 捷，王希付，代紅洋，陳嘉偉，許均博，曹冠華,2*，賀 森,2*

1.云南中醫藥大學中藥學院暨云南省南藥可持續利用重點實驗室，云南 昆明 650500

2.云南中醫藥大學 云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，云南 昆明 650500

多糖即多聚糖，廣泛存在于藥用植物中，如百合科、蘭科、五加科、茄科、唇形科、菊科等高等植物。作為中藥的重要質量標志物（quality marker，Q-Markers），在組織分布中，藥用植物的果實、根、莖和花中均存在多糖及其衍生物[1]。多糖結構較為復雜，一級結構主要由主鏈和支鏈組合而成，而主鏈的基本結構通常是葡聚糖、果聚糖、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等，或者是2 種及以上單糖的聚合物，支鏈則更為復雜多樣，故形成了多糖的復雜多樣性[2]。根據多糖異頭碳構型，多糖可以分為α、β 構型，研究表明，能夠在人體內發揮藥理活性的主要為β-多糖[3]。多糖在植物體中扮演著重要的角色，在能量儲存、結構支撐、信息存儲與識別、生理調節與免疫調控等方面發揮著重要作用。研究顯示，植物多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、免疫調節、降血糖、調血脂等藥理作用[4]。

目前對植物多糖的研究主要集中在多糖提取工藝、結構解析、藥理等方面，而對多糖生物合成通路研究相對較少，主要集中在關鍵酶基因的克隆、表達特性及功能鑒定方面，對多糖結構修飾、調控機制的研究尚處于起步階段。本文對藥用植物多糖合成通路及關鍵酶的研究進展進行了綜述，解析了植物多糖生物合成分子機制，不僅有益于了解藥用植物多糖的代謝通路，還可為多糖關鍵酶的研究提供理論參考。

1 多糖Q-Marker 多樣性分析

多糖的基本結構單元為單糖，單糖與單糖之間通過糖苷鍵相連接，形成線性或者分支的聚糖結構。單糖的組成、比例及聚合形式決定了多糖的多樣性。即使是同科屬植物，其多糖中單糖的組成與比例也存在一定的差異，使植物多糖的質量控制與品質鑒定產生很大區別?！癚-Markers”一詞的提出，掀起了藥用植物多糖的研究熱潮，多糖定性、定量成為其質量研究的重要方式。本文列舉了部分以多糖為主要Q-Markers 的藥用植物多糖分布部位、單糖組成和常見的藥理作用，見表1。

表1 部分藥用植物Q-Markers 多糖分布部位、單糖組成及藥理作用Table 1 Distribution, monosaccharide composition and pharmacological effects of quality markers polysaccharides of some medicinal plants

2 多糖生物合成

盡管植物多糖的結構千變萬化，但合成通路基本保持一致。通過總結已發表的文獻，發現植物多糖生物合成途徑主要包括3 個步驟：第1 步為蔗糖經過一系列轉化生成尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖、鳥苷二磷酸甘露糖（guanosine diphosphate，GDP）-甘露糖和鳥苷二磷酸巖藻糖（guanosine diphosphate fucose，GDP）-巖藻糖；第2 步為UDP-葡萄糖轉化為其他 NDP 單糖；最后通過不同的糖基轉移酶（glycosyl transferases，GTs）將單糖從糖核苷酸供體結合到生長中的多糖聚合物中，隨后這些重復單元被聚合和輸出，形成植物多糖（圖1）[18-20]。UDP-葡萄糖是多糖合成途徑中其他NDP 單糖合成的基礎，在整個合成的過程中起著至關重要的作用。

圖1 藥用植物多糖生物合成通路Fig.1 Biosynthetic pathway diagram of medicinal plant polysaccharides

2.1 蔗糖轉化步驟

藥用植物體內蔗糖主要通過光合作用形成。UDP-葡萄糖與果糖-6 磷酸酯在蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）作用下合成蔗糖磷酸酯，再經過蔗糖磷酸酯酶（sucrose phosphate phoshatase，SPP）催化生成蔗糖或由游離果糖與UDP-葡萄糖在SPS 催化下直接生成蔗糖。在多糖生物合成過程中，蔗糖轉化部分包括3 個不同方向：一個方向為在蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）的作用下直接生成UDP-葡萄糖；另一個方向為蔗糖由轉化酶（invertase，INV）催化生成葡萄糖，經己糖激酶（hexokinase，HK）催化生成6-磷酸 葡 萄 糖 ， 在 磷 酸 葡 萄 糖 變 位 酶（phosphoglucomutase，PGM）的作用下生成1-磷酸葡萄糖，再經UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDPglucose pyrophosphorylase，UGPase）生成UDP-葡萄糖；第3 個方向為蔗糖由SUS 催化生成果糖，經果糖激酶（fructokinase，FRK）轉化為6-磷酸果糖，再由葡萄糖-6-磷酸異構酶（glucose-6- phosphate isomerase，GPI）轉化為6-磷酸葡萄糖，然后在PGM 的作用下轉化為1-磷酸葡萄糖，最后由UGPase 轉化生成UDP-葡萄糖[21]。

此外，由蔗糖到GDP-甘露糖和GDP-巖藻糖的生物合成途徑亦基本清楚。首先，由SUS 催化蔗糖生成果糖，再經HK 轉化生成6-磷酸果糖。而后6-磷酸果糖經甘露糖-6-磷酸異構酶（mannose-6- phosphate isomerase，MPI）催化生成6-磷酸甘露糖，再由磷酸甘露糖突變酶（ phosphomannose isomerase，PMM）轉化為1-磷酸甘露糖，最后在GDP- 甘露糖焦磷酸化酶（ GDP-mannose pyrophosphorylase，GMPP）的作用下形成GDP-甘露糖。研究發現，GDP-甘露糖可以通過2 個步驟形成GDP-巖藻糖，首先在GDP-D-甘露糖-4,6-脫水酶（GDP-D-mannose-4,6-dehydratase，GMD）的作用下將GDP-D-甘露糖轉化為GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖，隨之由GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5-表觀酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5- epimerase-4-reductase，GER1）催化形成GDP-巖藻糖[22]。值得注意的是，GDP-甘露糖也可以作為合成UDP-鼠李糖、UDP-巖藻糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖等的前體物質[23]。

2.2 UDP-葡萄糖至其他NDP 單糖轉化步驟

2.2.1 UDP-半乳糖合成途徑 在UDP-葡萄糖-4-差向異構酶（UDP-glucose-4-epimerase，UGE）作用下，UDP-葡萄糖直接轉化生成UDP-半乳糖。而UDP 半乳糖又可經過半乳糖脫氫酶（UDP-D-galactose dehydrogenase，UGD）催化生成尿苷二磷酸半乳糖醛酸，形成另一分支[24]。

2.2.2 UDP-阿拉伯糖合成途徑 UDP-葡萄糖經葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenase，UGDH）催化作用生成UDP-葡萄糖醛酸之后再由UDP-木糖合酶（UDP-D-xylose synthase，UXS）作用下生成UDP-D-木糖，隨后繼續由UDP-D-木糖差向異構酶（UDP-D-xylosel-4-epimeras，UXE）和阿拉伯吡喃糖變位酶（UDP-arabinopyranose mutase，UAM）催化生成UDP-L-阿拉伯呋喃糖，并可進一步催化為UDP-L-阿拉伯吡喃糖。在該過程中，UDP-葡萄糖醛酸也可經木糖合成酶（UDP-D-apiose/UDP-D-Xylose synthase，AXS）催化生成UDP-D-芹菜糖。此外，由于UDP-葡萄糖醛酸和UDP-半乳糖醛酸之間能夠通過UDP-葡萄糖醛酸異構酶（UDP-glucose A-4- epimerase，GAE）相互轉化[25]，故進一步增加了多糖構成的復雜性。

2.2.3 UDP-鼠李糖合成途徑 以UDP-葡萄糖為底物，NAD+和NADPH 為輔因子，分3 步反應催化UDP-鼠李糖[26]，首先經鼠李糖合成酶（UDP-rhamnose synthase，RHM）催化生成UDP-葡萄糖-4-酮-6-脫氧葡萄糖，再由RHM 催化生成UDP-4-酮-6-脫氧鼠李糖，最后在RHM 催化下形成UDP-鼠李糖。

2.3 多糖聚合步驟

目前植物體內已知NDP 單糖有尿苷二磷酸單糖、鳥苷二磷酸單糖、胞苷二磷酸單糖等[27]。在天然產物生物合成的關鍵時刻，植物細胞質內形成UDP 單糖以及GDP 單糖之后，被核苷酸糖轉運蛋白轉運到高爾基體，在GTs 的作用下將這些單糖殘基從活性核苷酸糖轉移到延伸的多糖鏈上脫水、縮合從而形成多聚糖，并通過分泌囊泡的形式輸送到不同部位進行積累[28-29]。

3 多糖生物合成關鍵酶及作用機制

酶在多糖的合成途徑中發揮著至關重要的作用，根據多糖合成通路步驟可將關鍵酶對應的分成3 個部分：第1 部分主要包括SUS、SPS、INV、HK、FRK、UGPase、MPI、PMM、GMPP；第2 部分主要包括UGE、UGDH、URHM；最后一部分主要是GTs，其主要作用見表2。

表2 植物多糖合成主要關鍵酶及其作用Table 2 Main key enzymes in synthesis of plant polysaccharides and their functions

3.1 SUS

SUS 是植物體內參與蔗糖代謝的關鍵酶之一，在調控多糖合成中起到關鍵作用。SUS 能夠催化蔗糖可逆裂解為果糖和UDP-葡萄糖或腺苷二磷酸葡萄糖[30]。植物SUS 多肽鏈由N 端的細胞靶向結構域（cellular targeting domain，CTD），早期結瘤素（early nodulin，ENOD）40 多肽結合結構域，典型的糖基轉移酶折疊結構（GT-B）和C 末端組成[31]。目前已從8 種藥用植物中克隆出了蔗糖合成酶基因，其開放閱讀框約為2400 bp，相對分子質量約為92 000，所編碼的氨基酸序列為737～815 aa，部分生物學信息見表3。Zhang 等[32]從甘草中分別克隆出了GuSUS1、GuSUS2，結合UDP 葡萄糖含量變化，說明兩條基因編碼的酶對蔗糖的裂解有催化作用，并且不同生長時期2 個基因的表達量存有差異。張園等[33]對鐵皮石斛幼苗及二年生植株進行SUS家族基因克隆，發現SUS 的結構和功能并未改變；二年生鐵皮石斛SUS 基因表達量存在組織差異性，相對豐度為莖＞葉＞根。SUS 穩定性一直是該基因的關注點，對其進行穩定性進行分析，發現藥用植物SUS 穩定性遠低于細菌SUS，原因可能是因為細菌N-端截斷所引起的[32]，這為藥用植物SUS 的應用提供了良好的思路。

3.2 SPS

蔗糖磷酸合成酶被證明是多糖合成途徑的第一個限速酶，在光合作用產物向蔗糖和淀粉的分配中起到關鍵調控作用[74]。目前已從5 種藥用植物中克隆獲得了SPS 基因，其開放閱讀框約為3100 bp，所編碼的氨基酸序列長度在758～1061 aa，相對分子質量約為110 000，見表3。王麗君等[40]從寧夏枸杞中獲得了1 個SPS 基因（LbSPS），qRT-PCR 結果顯示，該基因在枸杞花中表達量最高，葉中表達水平較低。Aleman 等[44]對紫花苜蓿中SPS 基因進行了克隆及表達分析，發現MsSPSA表達增強在根瘤碳氮代謝中發揮著重要的作用。

3.3 INV

INV 又稱為β-呋喃果糖苷酶，在藥用植物中起到催化蔗糖降解為果糖和葡萄糖的作用，并參與細胞的滲透調節和貯藏器官中糖分的積累[75]，為下游合成多糖提供底物，因此INV 是植物體內多糖合成的關鍵酶之一。目前已從5 種藥用植物中克隆獲得了INV基因，其開放閱讀框約為1900 bp，所編碼的氨基酸長度介于455～714 aa，相對分子質量約為70 000。INV 不可或缺的的保守結構域有NDPNG、RDP、WECVD[76]，相關生物學信息見表3。苗小榮等[48]從鐵皮石斛中克隆出DoNI2基因，qRT-PCR 結果發現DoNI2基因在鐵皮石斛根、莖和葉中均有表達，在莖中表達量最高，根中最低；且不同生長年限根莖中DoNI2基因表達量與INV 酶活性呈顯著正相關。Huang 等[77]研究表明通過Cu 脅迫中藥羊蹄，發現根部酸性轉化酶基因表達量與非脅迫條件下相比存在顯著差異，且酸性轉化酶活性與重金屬耐性存在著一定關系。

3.4 HK 和FRK

HK 和FRK 是植物體內催化果糖磷酸化的2個關鍵酶。HK 和FRK 在植物體是調節控制植物生長和發育的信號分子[78-79]，是植物體內不可或缺的雙功能酶[80]，參與糖的信號傳導，它對糖的調控貫穿了整個生長發育的過程，對植物體內許多基因的表達起到激活或阻遏的作用。目前報道的藥用植物HK 共有4 種，多數HK基因含有9 個外顯子，開放閱讀框約為1490 bp，共編碼494～498 aa，相對分子質量在53 000 左右，相對穩定。關于FRK，目前已從枸杞、龍眼、琵琶克隆獲得，其放閱讀框在1000～2000 bp，共編碼180～569 aa 氨基酸，相對分子質量約為36 000。部分生物學信息見表3。

Niu 等[12]對不同磷水平處理下的滇黃精進行了HiSeq2500 轉錄組測序，共篩選出20 種與黃精多糖生物合成相關的基因，其中黃精多糖含量與HK 基因的表達呈負相關。趙建華等[54]從枸杞中克隆獲得了果糖激酶基因LbFRK7，發現LbFRK7在不同組織中均有表達，果實中的表達量最高，根中最低；隨著果實的發育，果實中LbFRK7基因的表達量呈先升后降的變化趨勢，這與果糖的磷酸化和積累密切相關。這些結果表明HK 和FRK 對藥用植物多糖合成與積累發揮著重要作用。

3.5 UGPase

UGPase 是植物、動物和真菌體內葡萄糖代謝的關鍵酶，能夠催化1-磷酸葡萄糖與尿苷三磷酸反應生成UDP-葡萄糖和焦磷酸鹽，從而為藥用植物合成纖維素、半纖維素、果膠、糖脂、糖蛋白等提供前體物質，因此也是多糖合成途徑關鍵酶之一[81]。目前共從4種藥用植物中克隆獲得了UGPase基因，開放閱讀框約為1500 bp，編碼465～510 aa，相對分子質量在51 000 左右，部分生物學信息見表3。孫晶等[58]研究了鐵皮石斛不同組織部位中UGPase基因的表達量，結果顯示，石斛根和莖中UGPase基因的表達量遠高于葉中，且該基因的表達量在高年生石斛中隨著木質化和糖分累積基本停止而降低。Wu 等[60]從膜莢黃芪中克隆了UGPase基因AmUGPase，并通過大腸桿菌異源表達功能驗證發現，該酶能夠在大腸桿菌中大量表達，表達量約為總細菌蛋白的40%，Northern blotting 雜交結果表明AmUGPase在黃芪的根、莖、葉及毛狀根中均有表達，且在根和毛狀根中的表達量較高。截至目前為止，UGPase 在多糖合成和積累中的作用機制仍不清楚，需進一步研究。

3.6 UGDH

UGDH 廣泛存在于動物、植物細胞中，是合成多種核苷酸糖的關鍵酶。UGDH 能夠催化UDP-葡萄糖轉化為UDP-葡萄糖醛酸，為細胞質膜上透明質酸、高爾基體中UDP-木糖和蛋白多糖的合成及高等動物體內激素的葡萄糖醛酸化提供前體物質[82]。就藥用植物而言，UGDH 的缺失會導致UDP-木糖合成受限，進而影響UDP-阿拉伯糖合成，導致嚴重的細胞壁組成缺陷，阻礙根系的發育。經統計，目前共從5 種藥用植物中克隆獲得了UGDH基因，相對比較保守，其開放閱讀框均為1443 bp，由480 aa 編碼而成，相對分子質量相對保持在52 000，相關生物學信息見表3。劉峰等[62]、徐小萍等[63]分別從苧麻和龍眼中克隆了UGDH基因BnUGDH和DlUGD6，組織表達特性分析顯示，BnUGDH在根、莖、葉、皮中均有表達，且莖中的表達量最高；DlUGD6在龍眼非胚性愈傷組織中表達量相對較高，推斷DlUGD6基因可能與龍眼生長發育各個階段中細胞壁多糖合成密切相關。

3.7 PMM 和GMPP

PMM 和GMPP 是植物體內合成GDP-甘露糖的關鍵酶，為GDP-甘露糖的合成提供前體物質，在植物多糖合成中發揮著重要作用[83]。目前共從5 種藥用植物體中克隆了PMM家族基因，其開放閱讀框在1000 bp 左右，編碼246～258 aa，相對分子質量約為28 000，相關生物學信息見表3。He 等[66]從鐵皮石斛中克隆了PMM基因DoPMM，其在根、莖、葉、花中均有表達，且處于營養期和生殖期時，莖中表達豐度較高，表明DoPMM與石斛多糖合成密切相關；通過擬南芥中過表達實驗發現，轉基因擬南芥中的多糖含量明顯增加；此外，DoPMM在響應非生物脅迫中同樣發揮著重要作用。曹守波等[67]發現霍山石斛PMM 基因CpPMM，具有時空差異性，結果期表達量最高，且表達量與多糖含量呈顯著相關性。

研究顯示，目前已從白及、鐵皮石斛、霍山石斛3 種藥用植物中克隆出了GMPP 基因，開放閱讀框在1086～1248 bp，編碼361～415 aa，相對分子質量約為40 000，相關生物學信息見表3。韓榮春等[69]從霍山石斛中克隆了DhGMP基因，qPCR 實驗結果顯示，DhGMP在霍山石斛根、莖、葉、花中均有表達，且莖中表達量最高，根中最低，且DhGMP表達量與多糖的含量高度相關。以上結果表明PMM 和GMPP 基因在藥用植物多糖生物合成中發揮著重要作用，但其作用機制仍需進一步研究。

3.8 RHM

在藥用植物細胞內，RHM 是調控鼠李糖合成的關鍵酶之一，主要負責催化UDP-葡萄糖轉化為UDP-鼠李糖。目前，關于植物RHM 研究報道較少，劉露等[71]從何首烏中克隆了RHM基因FmRHM1和FmRHM2，其開放閱讀框均為2013 bp，編碼670 aa，相對分子質量為75 000，qRT-PCR 實驗結果顯示，FmRHM1和FmRHM2基因在根中的表達量最低，與莖和葉相比均存在顯著差異，說明FmRHM基因可能與何首烏莖、葉中糖類生物代謝相關。

3.9 GTs

糖基化是大部分植物質量標志物生物合成的最后一步，GTs 作為該部分的關鍵酶，共有上百種酶參與了植物體內多糖的合成，起到催化形成糖苷鍵的作用。目前，CAZY 數據庫（http://www.cazy.org/）共注釋了115 個GTs基因家族，參與多糖的生物合成的GTs 主要有2 種類型：一種為含有單個跨膜結構域的GTs，另一種為含有多個跨膜結構域的GTs[84]。藥用植物多糖合成相關GTs 的研究主要集中于蘭科植物石斛，先后克隆了9 條GTs 家族基因，開放閱讀框為1000～2000 bp，編碼342～599 aa，相對分子質量約為50 000，見表3。He 等[72]克隆了8 條類纖維素合酶家族基因，其中將DoCSLA6導入擬南芥之后，與野生型植株相比甘露糖的含量得到顯著提高。Yu 等[73]所克隆的GT31 家族基因DoGALT2，在不同開花期該基因表達量與鐵皮石斛花粉黏液多糖含量呈正相關，與野生型植株相比，DoGALT2過表達植株半乳糖和含半乳糖的醇不溶性殘基明顯增高，并增強了對非生物脅迫的耐受性，表明該基因可能參與了半乳糖多糖的生物合成[73]。

4 結語與展望

基于現有研究可知，光合作用糖代謝產物是植物多糖的合成基礎物質，之后選擇性的進入多糖合成通路，其中SUS、INV、UGPase、FRK、GTs 等關鍵酶在多糖聚合過程中發揮著重要作用；UGE、UGDH、RHM 在UDP-葡萄糖的分配上作用顯著；PMM、PGM 則是鳥苷二磷酸單糖合成部分的關鍵酶。多糖作為諸多藥用植物的質量標志物，因組成單糖的種類和組成方式不同，其相對分子質量和功能也大相徑庭，相應的對關鍵酶基因的研究也不盡相同。橫向比較發現，目前對以根莖為主要藥用部位（黃精、玉竹、黨參、白及、鐵皮石斛等）植物多糖生物合成下游部分關鍵酶的研究多集中在GMPP、PMM。

質量標志物多糖是藥用植物體內重要的代謝產物之一，具有顯著的藥理活性。由于難以從藥用植物中獲得足量且結構均一的多糖，滿足生產和實踐需求，通過化學合成、生物工程或者植物組織培養的方法來促進多糖生產已成為當下思考和研究的熱點。比較發現生物代謝工程是發展多糖合成最具可行性的方法，但由于物質的合成是一個復雜的蛋白網絡調控結果，故明確多糖生物合成中每一關鍵酶的作用機制和催化活性成為目前首要解決的問題。受限于技術手段和研究偏好，目前對多糖合成關鍵酶的研究多集中于基因生物信息學的分析、目標基因克隆和組織表達特性分析，對諸多關鍵酶的作用機制則鮮有報道。在后續研究中，可以通過異源表達、體外酶促催化、基因敲除、RNA 干擾等技術來明確多糖合成關鍵酶的作用機制和催化活性，為人工合成目標多糖奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突